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【目的】:(1)构建淋球菌IgA蛋白酶中和表位原核表达载体,并在大肠杆菌中诱导表达,纯化表达产物6His-IgA蛋白酶中和表位融合蛋白,检测融合蛋白的免疫原性。(2)构建淋球菌IgA蛋白酶中和表位真核表达载体,通过生殖道粘膜途径接种,在动物体内表达相应产物,诱导粘膜免疫,为研制人用高效抗淋病核酸疫苗提供实验依据。【方法】:(1)IgA蛋白酶中和表位原核表达载体的构建、表达、纯化及其免疫原性鉴定通过PCR扩增淋球菌MS11株IgA蛋白酶编码基因1 601～2 722位序列,构建pQE30-IgA蛋白酶中和表位原核表达载体;测序正确后在大肠杆菌M15中诱导表达,包涵体重组蛋白经8M尿素变性后通过镍琼脂凝胶FF分离纯化,SDS-PAGE和Western-Blot分析及鉴定该纯化蛋白;后者经尿素浓度梯度透析复性、SDS-PAGE鉴定正确后,与佐剂混合于皮内多点注射免疫新西兰兔,诱导产生抗淋球菌IgA蛋白酶中和表位的多克隆抗体;以复性后的重组蛋白抗原包板,建立间接ELISA法,检测兔免疫血清中IgA蛋白酶中和表位的抗体效价。(2)构建IgA蛋白酶中和表位真核表达载体,诱导小鼠产生粘膜免疫通过PCR扩增淋球菌MS11株IgA蛋白酶编码基因1 601-2 722位序列,构建pcDNA3.1(-)-IgA蛋白酶中和表位真核表达载体;经鉴定后,制备重组质粒壳聚糖混合颗粒,通过阴道灌注法免疫小鼠,诱导其产生粘膜免疫,对照组免疫不含重组质粒的壳聚糖溶液和pcDNA3.1(-)壳聚糖混合颗粒溶液;第3周和第5周加强免疫一次,间接免疫荧光法检测目的抗原在小鼠阴道组织内的表达,ELISA法检测小鼠血清﹑阴道冲洗液中抗IgA蛋白酶中和表位的IgA和IgG类抗体。【结果】:(1)成功构建了淋球菌IgA蛋白酶中和表位的原核表达载体。通过PCR扩增获得的淋球菌IgA蛋白酶中和表位序列与GenBank报道的一致。所克隆的基因在大肠杆菌中获得高效表达,目的蛋白在菌体细胞内以包涵体形式存在,Western-Blot结果显示该纯化蛋白能被抗6-His单抗识别,复性后得到溶解状态的复性蛋白。免疫组兔血清中IgA蛋白酶中和表位抗体效价达1:6 400。(2)成功构建了淋球菌IgA蛋白酶中和表位真核表达载体。以壳聚糖为释放系统经阴道免疫后第4天开始,通过间接免疫荧光法检测,在免疫组小鼠阴道上皮细胞中可以观察到一定亮度的绿色荧光,提示IgA蛋白酶中和表位抗原能在小鼠阴道组织内表达。免疫组小鼠阴道冲洗液中检测到的抗IgA蛋白酶中和表位的sIgA水平明显高于对照组。【结论】:(1)成功构建了淋球菌pQE30-IgA蛋白酶中和表位原核表达载体,免疫动物后获得了具有较好免疫原性的纯化复性IgA蛋白酶中和表位蛋白。(2)成功构建了淋球菌pcDNA3.1(-)-IgA蛋白酶中和表位真核表达载体,其壳聚糖混合颗粒经阴道免疫小鼠,能诱导产生有效的生殖道粘膜免疫。(3)pcDNA3.1(-)-IgA蛋白酶中和表位蛋白能在小鼠阴道上皮组织内表达。