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钙敏感受体(Calcium sensing receptor,CaR)属于G蛋白偶联受体超家族中的C家族，通过激活磷脂酶C系统调节细胞内游离钙的浓度，主要参与维持机体钙稳态。前期工作证实CaR参与心肌缺血-再灌注(ischemia/reperfusioN,I/R)引发的钙超载及细胞凋亡，但具体机制不详。
目的：本实验将探究在心肌缺血-再灌注过程中，钙敏感受体参与IP3通路引起肌浆网的内钙耗竭，诱发肌浆网过度应激及由此引起凋亡的途径。同时证明钙敏感受体通过线粒体-肌浆网膜(mitochondrial associated ER membrane，MAM)引起线粒体内钙的变化从而导致线粒体凋亡通路活化的机制。此研究将完善心肌缺血-再灌注时钙超载诱发细胞凋亡的机制，为心肌缺血再灌注的防治提供一个新思路、新途径。
方法(1)在培养的乳鼠心肌细胞模拟缺氧-复氧，应用IP3信号通路不同抑制剂证明CaR作用于细胞信号转导通路的靶点；激动CaR后观察细胞内钙及肌浆网内钙的变化情况；内质网应激蛋白和相关凋亡蛋白的表达以及细胞凋亡的情况。
(2)观察培养的乳鼠心肌细胞的线粒体在缺氧-复氧时，激动CaR时线粒体内钙的变化，检测线粒体势能，观察激动CaR对线粒体凋亡蛋白表达的影响
结果(1)免疫荧光检测发现，3型IP3受体分布于胞浆和核周，2型受体分布于核内，但1型受体未在心肌细胞中检测到；与免疫荧光结果相似，Westernblot分析显示，2型和3型IP3受体在心肌细胞有表达，1型受体则未检测到。
(2)激光共聚焦显微镜结果显示，H-Re组(332±38nM)和Ca+Ni+Cd+H-Re(306±27nM)组的细胞内钙明显升高。NPS-2390+Ca+Ni+Cd+H-Re组(147±12nM)和2-APB+Ca+Ni+Cd+H-Re组(133±11nM)明显低于Ca+Ni+Cd+H-Re组。
(3)MTT结果显示，在H-Re组(80.2±4.8％)，Ca+Ni+Cd+H-Re(78.3±6.8％)组和Gd+Ni+Cd+H-Re(77.6±5.1％)组，细胞生存率明显低于对照组、NPS-2390+Ca+Ni+Cd+H-Re组(91.7±4.6％)、2-APB+Ca+Ni+Cd+H-Re组(88.3±5.2％)和RuR+Ca+Ni+Cd+H-Re(87.6±5.6％)组。
(4)Hoechst 33342染色法分析发现凋亡细胞呈现典型的染色质浓缩成团块状。细胞凋亡率在H-Re组(33±6％)、Ca+Ni+Cd+H-Re组(31±5％)和Gd+Ni+Cd+H-Re组(34±3％)组明显高于NPS-2390+Ca+Ni+Cd+H-Re组(20±4％)、2-APB+Ca+Ni+Cd+H-Re(18±4％)组和Ru+Ca+Ni+Cd+H-Re（23士5％）组。
(5)线粒体内钙浓度和线粒体膜电位的检测结果显示：在Ca+Ni+Cd+H-Re组，线粒体内钙浓度显著升高，线粒体膜电位明显下降；在2-APB+Ca+Ni+Cd+H-Re组，线粒体内钙浓度维持在较低水平，线粒体膜电位维持在较高水平。由于线粒体内钙的摄取是由线粒体膜上Ca2+单向转运体决定的，本实验应用Ruthenium red（线粒体钙单向转运体的抑制剂）。结果发现，在Ru+Ca+Ni+Cd+H-Re组，线粒体内钙维持在较低的水平，而线粒体膜电位维持在较高的水平。
(6)Western blot结果显示，钙敏感受体的表达在H-Re组和Ca+Ni+Cd+H-Re组明显升高；与对照组相比，内质网应激蛋白GRP78，p-PERK/PERK，ATF6的表达在H-Re组、Ca+Ni+Cd+H-Re组和NPS-2390+Ca+Ni+Cd+H-Re组明显升高；内质网过度应激相关的凋亡蛋白caspase-12，p-JNK/JNK的表达在H-Re组和Ca+Ni+Cd+H-Re组明显升高。线粒体途径诱发细胞凋亡的相关蛋白BAP31、bax、bad和cytc的表达在H-Re组和Ca+Ni+Cd+H-Re组均明显升高。
结论(1)钙敏感受体通过活化IP3通路，诱导内质网钙耗竭和内质网过度应激进而引起缺氧一复氧所致的心肌细胞凋亡。
(2)钙敏感受体通过线粒体-肌浆网膜引起线粒体内钙增加，激活线粒体凋亡途径而导致心肌细胞凋亡。