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中耳胆脂瘤是一种常见多发病,以中耳腔内高度增殖的角化鳞状上皮的积存,临近骨质的破坏为主要特征。胆脂瘤虽是一种良性病变,却具有恶性肿瘤样生物学行为,如侵袭性、迁移性、破坏性、复发性、高度增殖和分化变异性。中耳胆脂瘤所引起的骨质破坏可导致听力下降,内耳功能紊乱,面神经麻痹,甚至颅内并发症。临床观察发现,儿章胆脂瘤较成人更具侵袭性和危险性。多数学者认为,儿童胆脂瘤生长速度快,易于扩散,病变范围广泛,并且术后复发率明显高于成人。目前的治疗方法主要是手术切除,但由于术后易于复发或残留,常需多次手术,故并发症的发生和听功能的障碍尤为严重。
胆脂瘤发生的确切机制目前尚不明确。近年来,国内外学者从组织酶学、癌基因、细胞因子、生长因子及其受体等方面对胆脂瘤发生的分子机制进行了研究。结果发现,中耳胆脂瘤组织中许多生长因子和信号分子基因表达上调,同时与细胞增殖、分化、凋亡及骨质破坏相关的蛋白质表达也明显增强。尽管有关胆脂瘤细胞凋亡能力的研究结果仍存在分歧,但大量研究证实,与正常皮肤相比胆脂瘤上皮具有类似肿瘤细胞一样高度增殖的能力。
新近的研究发现,细胞的基本生物过程包括增殖、分化和死亡均受一类长20-30nt的小RNA分子,Micro(mi)RNA,通过作用于靶mRNA3端非翻译区罩的结合位点沉默靶基因表达来调控。miRNA是蛋白质翻译过程中重要的调节子,与肿瘤和异常增生性疾病的发生密切相关。据计算分析,大约miRNA的数量占到蛋白编码基因的1％,而高达30%的蛋白编码基因可能受到miRNA的调控。miRNA-21是人类细胞或组织中存在较为广泛的一个miRNA,主要通过其靶基因磷酸酶张力蛋白同源物(The phosphatase tension homologue,PTEN)和程序性细胞凋亡因子-4(Programmed cell death factor-4,PDCD4)在调控肿瘤异常增殖的过程中发挥着重要作用,因此又被称为“癌基因”。在炎症等的病理条件下,如LPS诱导的鼠的肺部炎症、过敏性呼吸道炎症、骨关节炎、银屑病、大肠炎、心室肥大,microRNA-21的表达增加。Sheedy等推测microRNA-21是炎症与癌症的连接桥梁。
有关miRNA对胆脂瘤上皮细胞增殖、分化和死亡调控作用的研究报道甚少。2009年Friedland等通过实时荧光定量PCR技术首次研究了胆脂瘤组织中一系列与肿瘤发生相关的miRNA的表达情况,发现miRNA-21调控胆脂瘤上皮的生长和增殖。2011年作者研究发现凋亡相关miRNA(apoptosis-associated miRNA)let-7a参与了胆脂瘤细胞凋亡调控作用,并且其调控模式不同于肿瘤细胞,而更类似于let-7a对损伤或炎症的调控。然而迄今为止,在细胞体外模型对胆脂瘤的发生和调控机制进行深入研究和干预实验尚未见报道。
本研究目的：
1.观察miRNA-21及其靶基因PTEN和PDCD4蛋白在儿章和成人中耳胆脂瘤组织中的表达情况,研究miRNA-21对儿童和成人中耳胆脂瘤上皮增殖和凋亡的作用。
2.建立中耳胆脂瘤细胞体外研究模型,研究miRNA-21和其下游靶基因PTEN、PDCD4蛋白在胆脂瘤角质细胞中的表达情况。
3.以介导miRNA-21抑制体的慢病毒载体感染培养的胆脂瘤角质细胞,观察下调miRNA-21对胆脂瘤角质细胞中miRNA-21及其靶基因PTEN和PDCD4蛋白表达的影响,以及细胞增殖、凋亡能力和侵袭性的改变,为丌展基于miRNA的基因治疗或联合治疗提供实验依据。
第一部分 MiRNA-21在儿童和成人中耳胆脂瘤组织中的表达研究
方法：
1.提取21例成人(年龄≥18岁)中耳胆脂瘤组织及其耳后正常皮肤组织,21例儿童(年龄≤14岁)中耳胆脂瘤及其耳后正常皮肤组织中的miRNAs,利用紫外分光光度仪检测miRNAs的浓度和纯度。
2.利用荧光定量PCR技术检测儿童、成人中耳胆脂瘤组织和儿童、成人耳后正常皮肤组织中miRNA-21的表达。
3.提取中耳胆脂瘤组织中的总蛋白,利用westem blotting技术检测miRNA-21下游靶基因PTEN和PDCD4蛋白在各组织中的表达。
结果：
1.MiRNA-21在中耳胆脂瘤组织中的表达高于耳后正常皮肤组织中的表达,在儿童中耳胆脂瘤组织中的表达高于成人中耳胆脂瘤组织(P<0.05),而在儿童耳后正常皮肤组织和成人耳后正常皮肤组织中的表达无差异(P>0.05)。
2.PTEN和PDCD4蛋白在胆脂瘤组织中的表达低于正常耳后皮肤组织中的表达(P0.05),在儿童中耳胆脂瘤组织中的表达低于成人中耳胆脂瘤组织(P<0.05),而在儿童耳后正常皮肤组织和成人耳后正常皮肤组织中的表达无差异(P>0.05)。
第二部分中耳胆脂瘤细胞无血清培养方法的建立及miRNA-21在胆脂瘤角质细胞中的表达
方法：
1.采用两步消化法对中耳胆脂瘤上皮和耳后正常皮肤组织进行消化,获取胆脂瘤角质细胞进行体外无血清培养基培养。
2.利用显微镜观察细胞形态和生长状态,并利用细胞免疫荧光化学对细胞性质进行鉴定。
3.利用荧光定量PCR技术和western blot技术分别检测miRNA-21及其下游靶基因PTEN和PDCD4蛋白在培养的胆脂瘤角质细胞和皮肽角质形成细胞中的表达。
结果：
1.两步消化无血清培养法可获得足够数量的胆脂瘤角质细胞,且细胞在体外活性良好,可稳定增殖。
2.角蛋白抗体检测提取胆脂瘤角质细胞的纯度可达90%以上,可用于后续实验。
3.MiRNA-21在胆脂瘤角质细胞中的表达是皮肤角质形成细胞中的4.06±0.08倍,差异有统计学意义(P<0.05);PTEN和PDCD4蛋白在胆脂瘤角质细胞中的表达低于皮肤角质形成细胞中的表达,差异有统计学意义(P<0.05)。
第三部分下调miRNA-21对胆脂瘤角质细胞中miRNA-21及其靶基因的表达以及细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响
方法：
1.实验分组:miR-21-inhibitor组(实验组),miR-21-NC组(阴性对照组),Mock组(空白对照组)
2.利用介导miRNA-21 inhibitor的慢病毒载体感染培养的胆脂瘤角质细胞,荧光显微镜观察病毒感染效率,荧光定量PCR技术检测miRNA-21的表达,初步确定miRNA-21 inhibitor的干扰效率。
3.利用western blotting检测miR-21 inhibitor干扰对胆脂瘤角质细胞中PTEN和PDCD4蛋白表达的影响。
4.将感染慢病毒后的胆脂瘤角质细胞以2×104/ml密度接种于96孔板中,培养12天,每天取3孔计细胞数并绘制生长曲线。
5.如上方法处理细胞,96h各组细胞经PI染色,用FCM法测定细胞周期分布。
6.EdU孵育18小时后,经Apollo(R)和Hoechst33342染色,利用荧光显微镜观察胆脂瘤细胞的增殖。
7.感染96h后分别利用Annexin V-FITC法观察细胞早期凋亡状况,TUNEL原位酶标记荧光显微镜法检测胆脂瘤细胞的凋亡。
8.利用Transwell细胞侵袭实验检测胆脂瘤角质细胞侵袭能力的变化。
结果：
1.MiR-21-inhibitor组的胆脂瘤角质细胞中miRNA-21的表达显著低于miR-21-NC组和Mock组,miRNA-21在miR-21-NC组中的表达是miR-21-inhibitor组的9.38±0.24倍,在Mock组中的表达是miR-21-inhibitor组的11.77±0.21倍,差异有统计学意义(P<0.05);而在miR-21-NC组和Mock组中的表达无差异(P>0.05)。
2.PTEN和PDCD4蛋白在胆脂瘤角质细胞miR-21-inhbitor组的表达较miR-21-NC组和Mock组明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);在miR-21-NC组和Mock组中的表达无明显差异(P>0.05)。
3.MiRNA-21 inhibitor干扰后胆脂瘤角质细胞生长和增殖受到抑制,第4天miR-21-inhibitor组的细胞密度与miR-21-NC组和Mock组比较差异有统计学意义(P<0.05),第6天两对照组细胞均呈指数增殖,而miR-21-inhibitor组仍缓慢增殖。
4.MiRNA-21 inhibitor感染胆脂瘤角质细胞96h,细胞周期出现G0/G1期细胞比例的增加(P<0.05),S期细胞比例的下降(P<0.05),即miRNA-21 inhibitor使胆脂瘤角质细胞G0/G1期至S期阻滞。
5.MiRNA-21 inhibitor感染后96h,EdU检测胆脂瘤角质细胞中,EdU阳性细胞数明显低于miR-21-NC组和Mock组,其细胞增殖率明显下降(P<0.05)。
6.MiRNA-21 inhibitor感染后96h,Annexin V-FITC检测胆脂瘤角质细胞的早期凋亡率有明显增加(P<0.05);通过TUNEL细胞原位杂交观察到胆脂瘤角质细胞晚期凋亡细胞比例的明显增加(P<0.05)
7.MiRNA-21 inhibitor组侵出小室的胆脂瘤角质细胞数和miR-21-NC组和Mock组中侵出小室的胆脂瘤角质细胞数无明显差异(P>0.05)。
结论：
1.中耳胆脂瘤组织中miRNA-21表达增高而其下游靶基因蛋白PTEN和PDCD4则相应减少,提示胆脂瘤上皮细胞增殖能力的增强;并且miRNA-21对儿童胆脂瘤细胞增殖能力的调控作用明显高于成人。
2.两步消化无血清培养法可获得足够数量的胆脂瘤角质细胞,细胞活性良好,能够稳定增殖;离体培养的中耳胆脂瘤胶质细胞保留了在体状态下较正常皮肤角质细胞增高的生长增殖能力,以及miRNA-21及其靶基因PTEN和PDCD4对其调控作用。
3.MiR-21 inhibitor慢病毒可有效沉默胆脂瘤角质细胞中miRNA-21的表达,同时通过负性调控其靶基因,使PTEN和PDCD4蛋白在胆脂瘤角质细胞中的表达升高。
4.MiR-21 inhibitor可有效抑制胆脂瘤角质细胞的增殖活性,同时促进细胞凋亡,提示miRNA-21可作为中耳胆脂瘤基因治疗的备选靶点。