论文部分内容阅读
mRNA的轴突定位和局部翻译对神经元的轴突发育十分重要。microRNA可以通过调控mRNA的转录后翻译，从而参与到mRNA的局部翻译调控过程中。之前的研究显示，microRNA对神经元树突的形态、功能和发育起到很重要的作用，然而，关于microRNA在轴突中的研究还比较少。 本课题研究了轴突富集的miR-181d对初级感觉神经元生长的影响及其调控机制。首先，通过建立胚胎E13.5天的初级感觉神经元微流小室分隔培养系统，分别提取神经元的轴突及胞体中的RNA。进一步利用实时定量PCR进行检测，我们发现miR-181d在初级感觉神经元的轴突中相对富集。双荧光素酶报告系统、免疫印迹和轴突生长实验显示miR-181d通过抑制微管骨架相关蛋白1B(MAP1B)和钙调蛋白(calmodulin)的mRNA（Map1b和Calm1）在轴突中的局部翻译，对神经元轴突的生长起到负调控的作用。其次，免疫共沉淀实验显示，PC12细胞和背根神经节(DRG，Dorsal root ganglion)组织中RNA结合蛋白FMRP(Fragile X mentalretardation protein)可以结合miR-181d及其靶基因Map1b和Calm1。原位杂交实验和细胞免疫荧光实验显示，FMRP与miR-181d、Map1b和Calm1在神经元轴突中存在共定位。再次，利用腺相关病毒敲减微流小室培养的E13.5天初级感觉神经元中的FMRP，可以降低miR-181d、Map1b和Calm1在轴突中的水平。同时，在fmr1I304N点突变小鼠的坐骨神经中也检测到miR-181d、Map1b和Calm1的水平降低。活细胞成像实验显示，FMRP敲减后会减少轴突中运输的Map1b和Calm1量，但并不影响其运输速率。此外，FMRP敲减后神经元轴突和mr1I304N点突变小鼠的坐骨神经中MAP1B和Calmodulin的蛋白含量都显著下降。最后，使用神经生长因子(NGF，Nerve growth factor)刺激神经元轴突，能够引起轴突中MAP1B和calmodulin蛋白量的增加，这一增加可以被蛋白翻译的抑制剂放线菌酮(CHX，Cycloheximide)所阻断。在PC12细胞中，NGF刺激能够促进Map1b和Calm1从FMRP复合体中释放，但不影响FMRP和miR-181d的相互结合。此外，在初级感觉神经元轴突中，NGF刺激可以显著加快轴突的生长，而在轴突过表达miR-181d会抑制NGF刺激所引起的轴突生长，在胞体敲减FMRP也会抑制NGF刺激所引起的轴突生长过程。 综上所述，我们的研究发现miR-181d在神经元轴突中富集，Map1b和Calm1是miR-181d下游的靶基因，miR-181d通过抑制Map1b和Calm1在轴突中的局部翻译对神经元轴突的生长起到负调控的作用。FMRP可以同时结合miR-181d及其靶基因Map1b和Calm1，参与了miR-181d、Map1b和Calm1在轴突中的运输。FMRP与miR-181d通过调控NGF诱导的Map1b和Calm1在轴突末梢中的局部翻译，进而影响初级感觉神经元轴突的生长。该研究有助于了解神经元中轴突定位的microRNA的功能和调控机制，也加深了我们对RNA结合蛋白作用和调节方式的理解。