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前言
缺血性脑血管病是严重危害人类生命健康的疾病,目前尚无有效的治疗方法,很多研究表明,在脑缺血急性期,如何有效挽救缺血半暗带区神经元凋亡对脑缺血患者的功能恢复非常重要。ATP敏感性钾通道(KATP)开放剂可促进神经细胞存活和再生、对抗神经元缺氧,是近年新兴的一种脑保护剂,但其作用机制尚不完全清楚。近年来一个新的生长因子介导的信号转导通路PI3K(phosphatidy linositol3-kinase,磷脂酰肌醇3-激酶)/AKT(v-akt murine thymoma viral oncogenehomolog,蛋白激酶B)逐渐被人们认识,研究表明它参与了许多细胞的抗凋亡、增殖、分化等,尤其对生长因子介导的神经元存活有明显的促进作用。PI3K/Akt能直接或间接磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB),发挥抗凋亡作用。本研究通过PCI2细胞培养方法,观察KATP通道开放剂对缺血缺氧诱导PC12细胞凋亡影响,及对缺血缺氧后PC12细胞p-Akt、p-CREB蛋白及mRNA的表达变化影响,探讨KATP通道开放剂的脑保护作用机制,为KATP通道开放剂能尽早应用于临床治疗缺血性脑血管病提供理论依据。
目的
观察KATP通道开放剂对缺血缺氧诱导PC12细胞凋亡影响,并进一步探讨KATP通道开放剂保护缺血缺氧诱导PC12细胞凋亡的信号转导机制,明确KATP通道开放剂是否通过PI3K/AKT/CREB信号转导通路来调控细胞凋亡,为KATP通道开放剂能尽早应用于临床治疗缺血性脑血管病提供理论依据。
实验方法
取传代后3d的PC12细胞,分为A组(正常对照组)、B组(缺血缺氧对照组)、C组(吡那地尔处理组)、D组(吡那地尔+格列吡嗪处理组)共4组。C组在PC12细胞缺血缺氧诱导前20min加入浓度为100μmol.L-1的KATP通道开放剂吡那地尔；D组则在缺血缺氧诱导前20min加入浓度100μmol.L-1的吡那地尔和浓度500μmol.L-1的KATP通道阻断剂格列吡嗪,采用Annexin-v FITC/PI双染流式细胞分析仪检测凋亡率,应用Western-blotting检测p-Akt、p-CREB蛋白表达水平,应用RT-PCR检测AKt、CREB mRNA:表达水平,观察KATP开放剂对缺血缺氧PC12细胞凋亡的保护作用。
实验结果
1、PC12细胞凋亡结果
B、C、D组细胞凋亡率随时间点增加而增加,24小时达高峰。以后随时间延长,逐渐降低。各个时间点B、C、D组细胞凋亡率均高于A组(P<0.05),C组和B、D组比较,细胞凋亡率均降低(P<0.05),B和D组比较无显著性差异(P>0.05).
2、蛋白免疫印迹结果
B、C、D组随时间延长p-Akt、p-CREB蛋白表达增加,12小时达高峰。以后逐渐减少。B、C、D组均高于对照组(P<0.05)。C组表达均高于B和D组(P<0.05)。B和D组比较无差异(P>0.05)。
3、半定量RT-PCR结果
B、C、D组随时间延长Akt、CREB mRNA表达增加,12小时达高峰。以后逐渐减少。B、C、D组均高于对照组(P<0.05)。C组表达均高于B和D组(P<0.05)。B和D组比较无差异(P>0.05)。
结论
KATP通道开放剂吡那地尔能明显降低缺血缺氧诱导后PC12细胞凋亡,增加p-AKt,p-CREB蛋白及mRNA表达,提示KATP通道开放剂可能通过激活PI3K/AKT/CREB途径来减少缺血缺氧后PC12细胞凋亡。
缺血性脑血管病是严重危害人类生命健康的疾病,目前尚无有效的治疗方法,很多研究表明,在脑缺血急性期,如何有效挽救缺血半暗带区神经元凋亡对脑缺血患者的功能恢复非常重要。ATP敏感性钾通道(KATP)开放剂可促进神经细胞存活和再生、对抗神经元缺氧,是近年新兴的一种脑保护剂,但其作用机制尚不完全清楚。近年来一个新的生长因子介导的信号转导通路PI3K(phosphatidy linositol3-kinase,磷脂酰肌醇3-激酶)/AKT(v-akt murine thymoma viral oncogenehomolog,蛋白激酶B)逐渐被人们认识,研究表明它参与了许多细胞的抗凋亡、增殖、分化等,尤其对生长因子介导的神经元存活有明显的促进作用。PI3K/Akt能直接或间接磷酸化cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB),发挥抗凋亡作用。本研究通过PCI2细胞培养方法,观察KATP通道开放剂对缺血缺氧诱导PC12细胞凋亡影响,及对缺血缺氧后PC12细胞p-Akt、p-CREB蛋白及mRNA的表达变化影响,探讨KATP通道开放剂的脑保护作用机制,为KATP通道开放剂能尽早应用于临床治疗缺血性脑血管病提供理论依据。
目的
观察KATP通道开放剂对缺血缺氧诱导PC12细胞凋亡影响,并进一步探讨KATP通道开放剂保护缺血缺氧诱导PC12细胞凋亡的信号转导机制,明确KATP通道开放剂是否通过PI3K/AKT/CREB信号转导通路来调控细胞凋亡,为KATP通道开放剂能尽早应用于临床治疗缺血性脑血管病提供理论依据。
实验方法
取传代后3d的PC12细胞,分为A组(正常对照组)、B组(缺血缺氧对照组)、C组(吡那地尔处理组)、D组(吡那地尔+格列吡嗪处理组)共4组。C组在PC12细胞缺血缺氧诱导前20min加入浓度为100μmol.L-1的KATP通道开放剂吡那地尔；D组则在缺血缺氧诱导前20min加入浓度100μmol.L-1的吡那地尔和浓度500μmol.L-1的KATP通道阻断剂格列吡嗪,采用Annexin-v FITC/PI双染流式细胞分析仪检测凋亡率,应用Western-blotting检测p-Akt、p-CREB蛋白表达水平,应用RT-PCR检测AKt、CREB mRNA:表达水平,观察KATP开放剂对缺血缺氧PC12细胞凋亡的保护作用。
实验结果
1、PC12细胞凋亡结果
B、C、D组细胞凋亡率随时间点增加而增加,24小时达高峰。以后随时间延长,逐渐降低。各个时间点B、C、D组细胞凋亡率均高于A组(P<0.05),C组和B、D组比较,细胞凋亡率均降低(P<0.05),B和D组比较无显著性差异(P>0.05).
2、蛋白免疫印迹结果
B、C、D组随时间延长p-Akt、p-CREB蛋白表达增加,12小时达高峰。以后逐渐减少。B、C、D组均高于对照组(P<0.05)。C组表达均高于B和D组(P<0.05)。B和D组比较无差异(P>0.05)。
3、半定量RT-PCR结果
B、C、D组随时间延长Akt、CREB mRNA表达增加,12小时达高峰。以后逐渐减少。B、C、D组均高于对照组(P<0.05)。C组表达均高于B和D组(P<0.05)。B和D组比较无差异(P>0.05)。
结论
KATP通道开放剂吡那地尔能明显降低缺血缺氧诱导后PC12细胞凋亡,增加p-AKt,p-CREB蛋白及mRNA表达,提示KATP通道开放剂可能通过激活PI3K/AKT/CREB途径来减少缺血缺氧后PC12细胞凋亡。