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目的：
冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary Atherosclerotic Heart Disease,CHD)是由冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。一项由国家心血管病中心组织编撰体现我国心血管疾病流行与防治的报告—《中国心血管病报告2018》中分析指出：目前我国约有3亿口人被确诊罹患心血管疾病，其中冠状动脉粥样硬化性心脏病患者人数超过1100万，位列心血管疾病第二，并且死亡率在心血管疾病中位列第一，这给社会和家庭带来了很大的负担。因此，安全有效的防治工作对降低冠心病的病亡率具有重要意义。血管内皮细胞功能障碍在冠心病的发生、发展过程中具有举足轻重的作用，其贯穿冠状动脉粥样硬化的始动、发展及临床事件整个过程。中医作为中华民族的瑰宝，历经时间的沉淀和反复验证，在保护血管内皮、改善血管内皮功能方面治疗冠心病具有独特优势。
近年来，随着高通量基因测序技术、基因转录组学的不断革新进步，非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)在各种疑难疾病中揭开神秘面纱，有关其在心血管疾病中研究不在少数，这为心血管疾病的防治提供重要思路，也为疾病的基因治疗夯实基础。牛磺酸上调基因1(Taurine up-regulated 1，TUG1)首先是在体外培养的新生小鼠视网膜细胞中被发现，后来被证实在损伤血管内皮细胞中高表达，可以通过介导血管内皮细胞的损伤参与心血管疾病的发病。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen- activated protein kinases，p38MAPK)信号通路的激活在内皮细胞损伤中发挥重要作用，可以通过磷酸化转录因子引起多种相关基因转录，调控活性物质的表达，参与血管内皮细胞氧化应激损伤、凋亡等过程。基于差异表达的LncRNATUG1与p38MAPK信号通路在冠心病血管内皮损伤中的重要作用，本研究将以保护血管内皮细胞作为切入点深入探讨小陷胸加味汤治疗冠心病作用机制，旨在为小陷胸加味汤的临床应用提供科学依据。
方法：
1.通过理论研究探索冠心病中医病名、病因病机、中医治疗的历史渊源及进展，揭示小陷胸汤治疗冠心病(痰热互结证)的中医辨证思路。基于中医药改善血管内皮功能治疗冠心病的独特优势，从基因层面及分子生物学层面挖掘小陷胸汤治疗冠心病(痰热互结证)可能潜在的作用机制，为下一步我们临床应用小陷胸加味汤治疗冠心病(痰热互结证)研究夯实理论基础。
2.小陷胸加味汤治疗冠心病(痰热互结证)的临床观察及血管内皮功能的影响。选取56例冠心病(痰热互结证)患者，随机分为小陷胸加味汤组和对照组，小陷胸加味汤组在对照组西医常规治疗基础上予以小陷胸加味汤，疗程均为30天，分别观察(1)临床指标：中医临床症状，心绞痛发作次数、持续时间及发作程度；(2)实验室指标：心电图检查记录心绞痛发作时S－T段及T波的变化；血管内皮相关指标一氧化氮(NO)和内皮素(ET)分泌水平；(3)药物不良反应评价指标：血常规、尿常规、肝肾功能等。
3.冠心病(痰热互结证)患者外周血LncRNATUG1与血管内皮损伤相关性研究。随机选取15例冠心病(痰热互结证)患者，另设健康对照组15例。所有入选对象取血6ml，Real-TimePCR法检测外周血单个核细胞中LncRNATUG1，免疫学方法测定循环内皮细胞计数，硝酸还原酶法测定一氧化氮分泌水平，放射免疫法测定内皮素分泌水平。采用Pearson相关分析，分别将LncRNATUG1与循环内皮细胞计数、一氧化氮、内皮素做相关分析。
4.基于中药血清药理学研究及时效关系研究，探索小陷胸汤加味汤调控差异表达的LncRNATUG1与p38MAPK信号通路保护血管内皮细胞的作用机制。选用SPF级SD大鼠经灌胃给药制备小陷胸加味汤含药血清及空白对照血清；TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)制备内皮损伤模型，MTT法筛选最佳含药血清浓度及作用时间。实验分为模型组、空白血清组、小陷胸加味汤含药血清组，分别应用运用培养基、空白组血清及最佳小陷胸加味汤含药血清进行干预。采用RT-PCR法检测小陷胸加味汤含药血清对TNF-α诱导的损伤HUVEC中LncRNATUG1的表达；WesternBlot检测TNF-α诱导的损伤HUVEC中p38MAPK信号通路相关蛋白p38、P-p38的表达水平。采用Pearson相关分析来分析差异表达的LncRNATUG1与内皮细胞p38MAPK信号通路相关蛋白p38、P-p38之间的相关性。
结果：
1.小陷胸汤源于《伤寒论》，后世医家在遵循原文的基础上不断扩义，明确提出在审明痰热互结病机的条件下，小陷胸汤能从多靶标、多途径、多层次改善血管内皮治疗冠心病。
2.小陷胸加味汤治疗冠心病(痰热互结证)的临床疗效及对血管内皮功能的影响。小陷胸加味汤组能明显改善心绞痛症状和中医证候，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，总有效率分别为92.86%和96.43%，心电图疗效总有效率为92.86%，优于对照组(P>0.05)。治疗后，两组NO分泌水平上调(P<0.05)，ET分泌水平降低(P<0.05)。两组治疗前后血常规、尿常规、肝肾功能等均无临床意义，小陷胸加味汤组出现1例胃痛(3.57%)，2例腹胀(7.14%)。对照组出现2例头昏、头痛(7.14%)，2例腹胀(7.14%)。
3.冠心病(痰热互结证)患者外周血LncRNATUG1与血管内皮损伤相关性研究。冠心病(痰热互结证)患者外周血中LncRNATUG1相对表达量增加；血管内皮损伤相关指标循环内皮细胞、ET的分泌水平、NO的分泌水平与健康对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，分别为循环内皮细胞计数增加，ET分泌增加，NO分泌降低。Pearson相关分析显示：冠心病(痰热互结证)患者外周血中LncRNATUG1与循环内皮细胞计数呈显著正相关(r=0.56，P=0.03)，与NO的分泌(r=-0.58，P=0.02)呈显著负相关，同时与ET的分泌水平呈显著正相关(r=0.62，P=0.01)。
4.小陷胸加味汤调控差异表达的lncRNATUG1与p38MAPK信号通路保护血管内皮细胞的作用机制。时效关系研究发现小陷胸加味汤含药血清以一定的时间-剂量依赖方式改善TNF-α诱导损伤HUVEC细胞的增值能力。最终选用20%小陷胸加味汤含药血清干预TNF-α诱导损伤HUVEC细胞24小时。Real-TimePCR结果显示，LncRNATUG1的相对表达水平在模型组的平均值为1.00，在空白血清组中的平均值为0.98，在20%小陷胸加味汤含药血清组中的平均值为0.96，小陷胸加味汤含药血清组与模型组、空白血清组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。WesternBlot结果显示，20%小陷胸加味汤含药血清组中p38、P-p38蛋白表达量明显下调，与模型组、空白血清组比较差异均具有显著统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析显示LncRNATUG1的相对表达量与p38、P-p38蛋白的表达呈显著正相关，分别为(r=0.997，P=0.048)，(r=0.990，P=0.017)。
结论：
1.小陷胸加味汤联合西医常规治疗能有效改善冠心病(痰热互结证)临床症状和血管内皮功能。
2.冠心病(痰热互结证)患者外周血LncRNATUG1表达具有差异性，差异表达的LncRNATUG1与血管内皮损伤存在一定相关性。
3.小陷胸加味汤含药血清能够通过调控差异表达的LncRNATUG1进而减少p38MAPK信号通路相关蛋白的表达,减轻内皮细胞损伤。
4.在审明病机的前提下，小陷胸加味汤可以从基因层面、分子生物学层面改善血管内皮功能治疗冠心病(痰热互结证)。
冠状动脉粥样硬化性心脏病(Coronary Atherosclerotic Heart Disease,CHD)是由冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病。一项由国家心血管病中心组织编撰体现我国心血管疾病流行与防治的报告—《中国心血管病报告2018》中分析指出：目前我国约有3亿口人被确诊罹患心血管疾病，其中冠状动脉粥样硬化性心脏病患者人数超过1100万，位列心血管疾病第二，并且死亡率在心血管疾病中位列第一，这给社会和家庭带来了很大的负担。因此，安全有效的防治工作对降低冠心病的病亡率具有重要意义。血管内皮细胞功能障碍在冠心病的发生、发展过程中具有举足轻重的作用，其贯穿冠状动脉粥样硬化的始动、发展及临床事件整个过程。中医作为中华民族的瑰宝，历经时间的沉淀和反复验证，在保护血管内皮、改善血管内皮功能方面治疗冠心病具有独特优势。
近年来，随着高通量基因测序技术、基因转录组学的不断革新进步，非编码RNA(noncoding RNA，ncRNA)在各种疑难疾病中揭开神秘面纱，有关其在心血管疾病中研究不在少数，这为心血管疾病的防治提供重要思路，也为疾病的基因治疗夯实基础。牛磺酸上调基因1(Taurine up-regulated 1，TUG1)首先是在体外培养的新生小鼠视网膜细胞中被发现，后来被证实在损伤血管内皮细胞中高表达，可以通过介导血管内皮细胞的损伤参与心血管疾病的发病。p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen- activated protein kinases，p38MAPK)信号通路的激活在内皮细胞损伤中发挥重要作用，可以通过磷酸化转录因子引起多种相关基因转录，调控活性物质的表达，参与血管内皮细胞氧化应激损伤、凋亡等过程。基于差异表达的LncRNATUG1与p38MAPK信号通路在冠心病血管内皮损伤中的重要作用，本研究将以保护血管内皮细胞作为切入点深入探讨小陷胸加味汤治疗冠心病作用机制，旨在为小陷胸加味汤的临床应用提供科学依据。
方法：
1.通过理论研究探索冠心病中医病名、病因病机、中医治疗的历史渊源及进展，揭示小陷胸汤治疗冠心病(痰热互结证)的中医辨证思路。基于中医药改善血管内皮功能治疗冠心病的独特优势，从基因层面及分子生物学层面挖掘小陷胸汤治疗冠心病(痰热互结证)可能潜在的作用机制，为下一步我们临床应用小陷胸加味汤治疗冠心病(痰热互结证)研究夯实理论基础。
2.小陷胸加味汤治疗冠心病(痰热互结证)的临床观察及血管内皮功能的影响。选取56例冠心病(痰热互结证)患者，随机分为小陷胸加味汤组和对照组，小陷胸加味汤组在对照组西医常规治疗基础上予以小陷胸加味汤，疗程均为30天，分别观察(1)临床指标：中医临床症状，心绞痛发作次数、持续时间及发作程度；(2)实验室指标：心电图检查记录心绞痛发作时S－T段及T波的变化；血管内皮相关指标一氧化氮(NO)和内皮素(ET)分泌水平；(3)药物不良反应评价指标：血常规、尿常规、肝肾功能等。
3.冠心病(痰热互结证)患者外周血LncRNATUG1与血管内皮损伤相关性研究。随机选取15例冠心病(痰热互结证)患者，另设健康对照组15例。所有入选对象取血6ml，Real-TimePCR法检测外周血单个核细胞中LncRNATUG1，免疫学方法测定循环内皮细胞计数，硝酸还原酶法测定一氧化氮分泌水平，放射免疫法测定内皮素分泌水平。采用Pearson相关分析，分别将LncRNATUG1与循环内皮细胞计数、一氧化氮、内皮素做相关分析。
4.基于中药血清药理学研究及时效关系研究，探索小陷胸汤加味汤调控差异表达的LncRNATUG1与p38MAPK信号通路保护血管内皮细胞的作用机制。选用SPF级SD大鼠经灌胃给药制备小陷胸加味汤含药血清及空白对照血清；TNF-α诱导人脐静脉内皮细胞(HUVEC)制备内皮损伤模型，MTT法筛选最佳含药血清浓度及作用时间。实验分为模型组、空白血清组、小陷胸加味汤含药血清组，分别应用运用培养基、空白组血清及最佳小陷胸加味汤含药血清进行干预。采用RT-PCR法检测小陷胸加味汤含药血清对TNF-α诱导的损伤HUVEC中LncRNATUG1的表达；WesternBlot检测TNF-α诱导的损伤HUVEC中p38MAPK信号通路相关蛋白p38、P-p38的表达水平。采用Pearson相关分析来分析差异表达的LncRNATUG1与内皮细胞p38MAPK信号通路相关蛋白p38、P-p38之间的相关性。
结果：
1.小陷胸汤源于《伤寒论》，后世医家在遵循原文的基础上不断扩义，明确提出在审明痰热互结病机的条件下，小陷胸汤能从多靶标、多途径、多层次改善血管内皮治疗冠心病。
2.小陷胸加味汤治疗冠心病(痰热互结证)的临床疗效及对血管内皮功能的影响。小陷胸加味汤组能明显改善心绞痛症状和中医证候，与对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)，总有效率分别为92.86%和96.43%，心电图疗效总有效率为92.86%，优于对照组(P>0.05)。治疗后，两组NO分泌水平上调(P<0.05)，ET分泌水平降低(P<0.05)。两组治疗前后血常规、尿常规、肝肾功能等均无临床意义，小陷胸加味汤组出现1例胃痛(3.57%)，2例腹胀(7.14%)。对照组出现2例头昏、头痛(7.14%)，2例腹胀(7.14%)。
3.冠心病(痰热互结证)患者外周血LncRNATUG1与血管内皮损伤相关性研究。冠心病(痰热互结证)患者外周血中LncRNATUG1相对表达量增加；血管内皮损伤相关指标循环内皮细胞、ET的分泌水平、NO的分泌水平与健康对照组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)，分别为循环内皮细胞计数增加，ET分泌增加，NO分泌降低。Pearson相关分析显示：冠心病(痰热互结证)患者外周血中LncRNATUG1与循环内皮细胞计数呈显著正相关(r=0.56，P=0.03)，与NO的分泌(r=-0.58，P=0.02)呈显著负相关，同时与ET的分泌水平呈显著正相关(r=0.62，P=0.01)。
4.小陷胸加味汤调控差异表达的lncRNATUG1与p38MAPK信号通路保护血管内皮细胞的作用机制。时效关系研究发现小陷胸加味汤含药血清以一定的时间-剂量依赖方式改善TNF-α诱导损伤HUVEC细胞的增值能力。最终选用20%小陷胸加味汤含药血清干预TNF-α诱导损伤HUVEC细胞24小时。Real-TimePCR结果显示，LncRNATUG1的相对表达水平在模型组的平均值为1.00，在空白血清组中的平均值为0.98，在20%小陷胸加味汤含药血清组中的平均值为0.96，小陷胸加味汤含药血清组与模型组、空白血清组比较，差异具有统计学意义(P<0.05)。WesternBlot结果显示，20%小陷胸加味汤含药血清组中p38、P-p38蛋白表达量明显下调，与模型组、空白血清组比较差异均具有显著统计学意义(P<0.05)。Pearson相关分析显示LncRNATUG1的相对表达量与p38、P-p38蛋白的表达呈显著正相关，分别为(r=0.997，P=0.048)，(r=0.990，P=0.017)。
结论：
1.小陷胸加味汤联合西医常规治疗能有效改善冠心病(痰热互结证)临床症状和血管内皮功能。
2.冠心病(痰热互结证)患者外周血LncRNATUG1表达具有差异性，差异表达的LncRNATUG1与血管内皮损伤存在一定相关性。
3.小陷胸加味汤含药血清能够通过调控差异表达的LncRNATUG1进而减少p38MAPK信号通路相关蛋白的表达,减轻内皮细胞损伤。
4.在审明病机的前提下，小陷胸加味汤可以从基因层面、分子生物学层面改善血管内皮功能治疗冠心病(痰热互结证)。