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目的
探讨从肝论治针灸对改良Hulth法制备的内侧间室OA模型大鼠软骨组织的影响，初步阐明从肝论治针灸防治OA模型大鼠软骨组织损伤的效应及昼夜节律作用机制，以期为从肝论治防治OA提供科学实验依据。
方法
实验一
选用30只12周龄SPF级雄性SD大鼠，随机分为模型组、假手术组、正常组，每组10只。模型组，采用改良Hulth法，切开右膝关节前内侧皮肤，钝性分离，暴露股骨内侧髁及关节囊，依次切断内侧副韧带和前交叉韧带，剔除内侧半月板，假手术组仅切开并暴露股骨内侧髁及关节囊，而正常组未予任何手术处理。术后1周，将大鼠放入跑台运动装置每天跑30min，持续3周以复制OA模型。造模术后每周进行旷场实验、足底痛阈测试实验、膝关节活动度等行为学检测，影象学检查右膝关节，关节液中TNF-α、IL-1β含量使用免疫酶联ELISA法检测，软骨损伤情况使用关节标本HE染色及Mankin评分观察，软骨组织中Bmal1、Clock蛋白含量使用免疫荧光法和免疫印迹法检测。
实验二
将40只12周龄雄性SPF级SD大鼠随机平均分为正常组、从肝论治取穴组、常规取穴组、模型组。其中正常组不做处理，另3组均予造模。治疗从造模手术后4周开始(即跑台3周结束后开始治疗)，共治疗4周。从肝论治取穴组取阳陵泉、肝俞、太冲，常规取穴组取足三里、外膝眼、内膝眼。造模术后每周进行旷场实验、足底痛阈测试实验、膝关节活动度等行为学检测，关节液中IL-1β、TNF-α含量使用免疫酶联ELISA法检测，关节软骨损伤情况使用标本HE染色及Mankin评分观察，软骨组织中Bmal1、Clock蛋白含量使用免疫荧光法和免疫印迹法检测。
实验三
将50只12周龄雄性SPF级SD大鼠随机平均分为5组。各组处理如下：1)正常组：不手术，不治疗。2)模型组：仅造模，不治疗。3)ERK抑制剂组：造模，手术4周后腹腔注射ERK抑制剂，连续注射28天。4)从肝论治取穴组：造模，手术4周后针灸治疗，从肝论治取穴选取肝俞、太冲、阳陵泉。5)ERK抑制剂+从肝论治取穴组：造模，手术4周后腹腔注射ERK抑制剂，连续注射28天，同时进行针灸治疗，从肝论治取穴选取肝俞、太冲、阳陵泉。治疗结束后，关节标本HE染色及Mankin评分观察软骨损伤情况，免疫酶联ELISA法检测关节液中IL-1β、TNF-α含量，并通过免疫荧光法和免疫印迹法检测软骨组织中Bmal1、Clock、P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白含量。
结果
实验一
1.大鼠术后第1周，与正常组相比，模型组活动总距离、活动速度、机械痛阈值、热痛阈值、关节活动度减小，休息时间延长(P＜0.01)，假手术组仅活动速度、机械痛阈值、热痛阈值减小(P＜0.01)，而活动总距离、休息时间、关节活动度差异无统计学意义(P＞0.05)，与模型组相比，假手术组活动总距离、活动速度、关节活动度增加，休息时间减少(P＜0.01)；术后第2-4周，与正常组相比，模型组活动总距离、活动速度、机械痛阈值、热痛阈值、关节活动度减小，休息时间延长(P＜0.01)，而假手术组旷场实验、机械痛阈值、热痛阈值、关节活动度差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.大鼠膝关节炎影象学检查显示，正常组和假手术组：右膝关节可见关节间隙存在，且内外侧间隙均匀一致，未见明显骨赘及骨破损。
模型组：右膝关节可见关节间隙变窄，且内侧间隙小于外侧，有明显骨赘形成。
3.软骨标本HE染色显示，与正常组相比，模型组Markin评分明显升高(P<0.01)，假手术组Markin评分差异无统计学意义(p＞0.05)。
4.采用免疫酶联ELISA法检测大鼠右膝关节液显示，与正常组相比，假手术组IL-1β、TNF-α的含量差异不明显(P＞0.05)，模型组IL-1β、TNF-α的含量明显增多(P<0.01)。
5.免疫荧光法和免疫印迹法检测大鼠膝关节软骨组织显示，与正常组相比，模型组Bmal1，Clock蛋白的表达明显下降(P＜0.01)，而假手术组Bmal1，Clock蛋白的表达无显著性差异(P＞0.05)。
实验二
1.大鼠术后1周，与正常组相比，其他各组旷场实验、热痛阈值、机械痛阈值、关节活动度有显著性差异(P<0.05)，但造模组间差异无统计学意义(P＞0.05)；术后第2-4周，与正常组相比，其他各组大鼠活动总距离、活动速度、热痛阈值、机械痛阈值、关节活动度减小(P＜0.05)，休息时间明显延长(P＜0.05)，但造模组间差异无统计学意义(P＞0.05)；大鼠术后第5-8周，与正常组相比，其他各组活动总距离、活动速度、热痛阈值、机械痛阈值、右膝关节活动度明显降低(P＜0.05)，休息时间明显延长(P＜0.05)，与模型组相比，常规取穴组和从肝论治取穴组均能提高大鼠活动总距离、热痛阈值、机械痛阈值、右膝关节活动度，并减少休息时间(P＜0.05)，且从第6周开始常规取穴组和从肝论治取穴组均能提高大鼠运动速度(P＜0.05)，与常规取穴组相比，从肝论治取穴组明能提高大鼠活动总距离、热痛阈值、机械痛阈值、右膝关节活动度，并减少休息时间(P＜0.05)，且从第7周开始从肝论治取穴组能明显提高大鼠活动速度(P＜0.05)。
2.软骨标本HE染色显示，与正常组比，其他各组Markin评分均增高(P＜0.01)；与模型组相比，常规取穴组和从肝论治取穴组Markin评分均明显降低(P＜0.01)；与常规取穴组相比，从肝论治取穴组Markin评分稍低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。
3.采用免疫酶联ELISA法检测大鼠右膝关节液显示，与正常组相比，其他组TNF-α、IL-1β的含量增多(P＜0.01)；与模型组相比，常规取穴组和从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量明显减少(P＜0.05)；与常规取穴组相比，从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量更少(P＜0.05)。
4.免疫荧光法和免疫印迹法检测大鼠关节软骨组织显示，与正常组相比，其他各组Bmal1、Clock蛋白含量均下降(P＜0.01)；与模型组相比，常规取穴组和从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白含量均升高(P＜0.01)；与常规取穴组相比，从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白含量均升高(P＜0.05)。
实验三
1.软骨标本HE染色显示，从Markin评分来看，与正常组比，其他组均明显增高(P＜0.001)；与模型组相比，从肝论治取穴组、ERK抑制剂组和ERK抑制剂+从肝论治取穴组均明显降低(P＜0.01)；与ERK抑制剂组相比，从肝论治取穴组Markin’s评分差异无统计学意义(p＞0.05)，ERK抑制剂+从肝论治取穴组Markin’s评分明显降低(p＜0.05)；与从肝论治取穴组相比，ERK抑制剂+从肝论治取穴组Markin’s评分明显降低(p＜0.05)。
2.采用免疫酶联ELISA法检测大鼠右膝关节液中IL-1β、TNF-α的含量显示，与正常组比，其他组明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，ERK抑制剂组、从肝论治取穴组和ERK抑制剂+从肝论治取穴组明显减少(P＜0.01)；与ERK抑制剂组相比，从肝论治取穴组差异无统计学意义(P＞0.05)，ERK抑制剂+从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量更少(P＜0.05)；与从肝论治取穴组相比，ERK抑制剂+从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量更少(P＜0.05)。
3.免疫荧光法和免疫印迹法检测大鼠关节软骨组织显示，与正常组相比，其他各组Bmal1、Clock蛋白表达量均下降(P＜0.05)，P-ERK、
IL-1β、TNF-α蛋白表达量明显增多(P＜0.05)；与模型组相比，ERK抑制剂组、从肝论治取穴组和ERK抑制剂+从肝论治取穴组大鼠膝关节软骨组织中Bmal1、Clock蛋白表达量均增多(P＜0.01)，P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量均明显减少(P＜0.01)；与ERK抑制剂组相比，从肝论治取穴组Bmal1、Clock、P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量差异无统计学意义(P＞0.05)，ERK抑制剂+从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白表达量增多(P＜0.05)，P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量减少(P＜0.05)；与从肝论治取穴组相比，ERK抑制剂+从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白表达量较高(P＜0.05)，P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量明显减少(P＜0.05)。
结论
1.采用改良Hulth法造模可以有效复制内侧间室OA模型，且模型昼夜节律蛋白存在异常。
2.从肝论治针灸治疗内侧间室OA效果优于常规取穴针灸。
3.从肝论治针灸可以改善内侧间室OA关节功能，修复损伤软骨，可能与昼夜节律蛋白抑制ERK1/2的磷酸化，减少炎症物质产生、减少软骨基质破坏有关。
探讨从肝论治针灸对改良Hulth法制备的内侧间室OA模型大鼠软骨组织的影响，初步阐明从肝论治针灸防治OA模型大鼠软骨组织损伤的效应及昼夜节律作用机制，以期为从肝论治防治OA提供科学实验依据。
方法
实验一
选用30只12周龄SPF级雄性SD大鼠，随机分为模型组、假手术组、正常组，每组10只。模型组，采用改良Hulth法，切开右膝关节前内侧皮肤，钝性分离，暴露股骨内侧髁及关节囊，依次切断内侧副韧带和前交叉韧带，剔除内侧半月板，假手术组仅切开并暴露股骨内侧髁及关节囊，而正常组未予任何手术处理。术后1周，将大鼠放入跑台运动装置每天跑30min，持续3周以复制OA模型。造模术后每周进行旷场实验、足底痛阈测试实验、膝关节活动度等行为学检测，影象学检查右膝关节，关节液中TNF-α、IL-1β含量使用免疫酶联ELISA法检测，软骨损伤情况使用关节标本HE染色及Mankin评分观察，软骨组织中Bmal1、Clock蛋白含量使用免疫荧光法和免疫印迹法检测。
实验二
将40只12周龄雄性SPF级SD大鼠随机平均分为正常组、从肝论治取穴组、常规取穴组、模型组。其中正常组不做处理，另3组均予造模。治疗从造模手术后4周开始(即跑台3周结束后开始治疗)，共治疗4周。从肝论治取穴组取阳陵泉、肝俞、太冲，常规取穴组取足三里、外膝眼、内膝眼。造模术后每周进行旷场实验、足底痛阈测试实验、膝关节活动度等行为学检测，关节液中IL-1β、TNF-α含量使用免疫酶联ELISA法检测，关节软骨损伤情况使用标本HE染色及Mankin评分观察，软骨组织中Bmal1、Clock蛋白含量使用免疫荧光法和免疫印迹法检测。
实验三
将50只12周龄雄性SPF级SD大鼠随机平均分为5组。各组处理如下：1)正常组：不手术，不治疗。2)模型组：仅造模，不治疗。3)ERK抑制剂组：造模，手术4周后腹腔注射ERK抑制剂，连续注射28天。4)从肝论治取穴组：造模，手术4周后针灸治疗，从肝论治取穴选取肝俞、太冲、阳陵泉。5)ERK抑制剂+从肝论治取穴组：造模，手术4周后腹腔注射ERK抑制剂，连续注射28天，同时进行针灸治疗，从肝论治取穴选取肝俞、太冲、阳陵泉。治疗结束后，关节标本HE染色及Mankin评分观察软骨损伤情况，免疫酶联ELISA法检测关节液中IL-1β、TNF-α含量，并通过免疫荧光法和免疫印迹法检测软骨组织中Bmal1、Clock、P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白含量。
结果
实验一
1.大鼠术后第1周，与正常组相比，模型组活动总距离、活动速度、机械痛阈值、热痛阈值、关节活动度减小，休息时间延长(P＜0.01)，假手术组仅活动速度、机械痛阈值、热痛阈值减小(P＜0.01)，而活动总距离、休息时间、关节活动度差异无统计学意义(P＞0.05)，与模型组相比，假手术组活动总距离、活动速度、关节活动度增加，休息时间减少(P＜0.01)；术后第2-4周，与正常组相比，模型组活动总距离、活动速度、机械痛阈值、热痛阈值、关节活动度减小，休息时间延长(P＜0.01)，而假手术组旷场实验、机械痛阈值、热痛阈值、关节活动度差异无统计学意义(P＞0.05)。
2.大鼠膝关节炎影象学检查显示，正常组和假手术组：右膝关节可见关节间隙存在，且内外侧间隙均匀一致，未见明显骨赘及骨破损。
模型组：右膝关节可见关节间隙变窄，且内侧间隙小于外侧，有明显骨赘形成。
3.软骨标本HE染色显示，与正常组相比，模型组Markin评分明显升高(P<0.01)，假手术组Markin评分差异无统计学意义(p＞0.05)。
4.采用免疫酶联ELISA法检测大鼠右膝关节液显示，与正常组相比，假手术组IL-1β、TNF-α的含量差异不明显(P＞0.05)，模型组IL-1β、TNF-α的含量明显增多(P<0.01)。
5.免疫荧光法和免疫印迹法检测大鼠膝关节软骨组织显示，与正常组相比，模型组Bmal1，Clock蛋白的表达明显下降(P＜0.01)，而假手术组Bmal1，Clock蛋白的表达无显著性差异(P＞0.05)。
实验二
1.大鼠术后1周，与正常组相比，其他各组旷场实验、热痛阈值、机械痛阈值、关节活动度有显著性差异(P<0.05)，但造模组间差异无统计学意义(P＞0.05)；术后第2-4周，与正常组相比，其他各组大鼠活动总距离、活动速度、热痛阈值、机械痛阈值、关节活动度减小(P＜0.05)，休息时间明显延长(P＜0.05)，但造模组间差异无统计学意义(P＞0.05)；大鼠术后第5-8周，与正常组相比，其他各组活动总距离、活动速度、热痛阈值、机械痛阈值、右膝关节活动度明显降低(P＜0.05)，休息时间明显延长(P＜0.05)，与模型组相比，常规取穴组和从肝论治取穴组均能提高大鼠活动总距离、热痛阈值、机械痛阈值、右膝关节活动度，并减少休息时间(P＜0.05)，且从第6周开始常规取穴组和从肝论治取穴组均能提高大鼠运动速度(P＜0.05)，与常规取穴组相比，从肝论治取穴组明能提高大鼠活动总距离、热痛阈值、机械痛阈值、右膝关节活动度，并减少休息时间(P＜0.05)，且从第7周开始从肝论治取穴组能明显提高大鼠活动速度(P＜0.05)。
2.软骨标本HE染色显示，与正常组比，其他各组Markin评分均增高(P＜0.01)；与模型组相比，常规取穴组和从肝论治取穴组Markin评分均明显降低(P＜0.01)；与常规取穴组相比，从肝论治取穴组Markin评分稍低，但差异无统计学意义(P＞0.05)。
3.采用免疫酶联ELISA法检测大鼠右膝关节液显示，与正常组相比，其他组TNF-α、IL-1β的含量增多(P＜0.01)；与模型组相比，常规取穴组和从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量明显减少(P＜0.05)；与常规取穴组相比，从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量更少(P＜0.05)。
4.免疫荧光法和免疫印迹法检测大鼠关节软骨组织显示，与正常组相比，其他各组Bmal1、Clock蛋白含量均下降(P＜0.01)；与模型组相比，常规取穴组和从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白含量均升高(P＜0.01)；与常规取穴组相比，从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白含量均升高(P＜0.05)。
实验三
1.软骨标本HE染色显示，从Markin评分来看，与正常组比，其他组均明显增高(P＜0.001)；与模型组相比，从肝论治取穴组、ERK抑制剂组和ERK抑制剂+从肝论治取穴组均明显降低(P＜0.01)；与ERK抑制剂组相比，从肝论治取穴组Markin’s评分差异无统计学意义(p＞0.05)，ERK抑制剂+从肝论治取穴组Markin’s评分明显降低(p＜0.05)；与从肝论治取穴组相比，ERK抑制剂+从肝论治取穴组Markin’s评分明显降低(p＜0.05)。
2.采用免疫酶联ELISA法检测大鼠右膝关节液中IL-1β、TNF-α的含量显示，与正常组比，其他组明显升高(P＜0.01)；与模型组相比，ERK抑制剂组、从肝论治取穴组和ERK抑制剂+从肝论治取穴组明显减少(P＜0.01)；与ERK抑制剂组相比，从肝论治取穴组差异无统计学意义(P＞0.05)，ERK抑制剂+从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量更少(P＜0.05)；与从肝论治取穴组相比，ERK抑制剂+从肝论治取穴组IL-1β、TNF-α的含量更少(P＜0.05)。
3.免疫荧光法和免疫印迹法检测大鼠关节软骨组织显示，与正常组相比，其他各组Bmal1、Clock蛋白表达量均下降(P＜0.05)，P-ERK、
IL-1β、TNF-α蛋白表达量明显增多(P＜0.05)；与模型组相比，ERK抑制剂组、从肝论治取穴组和ERK抑制剂+从肝论治取穴组大鼠膝关节软骨组织中Bmal1、Clock蛋白表达量均增多(P＜0.01)，P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量均明显减少(P＜0.01)；与ERK抑制剂组相比，从肝论治取穴组Bmal1、Clock、P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量差异无统计学意义(P＞0.05)，ERK抑制剂+从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白表达量增多(P＜0.05)，P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量减少(P＜0.05)；与从肝论治取穴组相比，ERK抑制剂+从肝论治取穴组Bmal1、Clock蛋白表达量较高(P＜0.05)，P-ERK、IL-1β、TNF-α蛋白表达量明显减少(P＜0.05)。
结论
1.采用改良Hulth法造模可以有效复制内侧间室OA模型，且模型昼夜节律蛋白存在异常。
2.从肝论治针灸治疗内侧间室OA效果优于常规取穴针灸。
3.从肝论治针灸可以改善内侧间室OA关节功能，修复损伤软骨，可能与昼夜节律蛋白抑制ERK1/2的磷酸化，减少炎症物质产生、减少软骨基质破坏有关。