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间变性淋巴瘤酶(ALK，anaplastic lymphoma kinase)是一种受体型跨膜酪氨酸激酶，属于胰岛素受体超家族。2007年，Nature上首次报道了Soda等人于非小细胞肺癌(NSCLC)患者中发现微管相关蛋白样4—间变性淋巴瘤激酶融合蛋白(echinoderm microtubule associated-protein like4-anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK)。EML4-ALK的异常活化能够促进肿瘤的增殖和存活。非小细胞肺癌患者中约5-7％的患者是由EML4-ALK异常活化引起。 针对ALK异常活化引起的非小细胞肺癌(NSCLC)，美国FDA于2011年批准了第一个ALK抑制剂Crizotinib（辉瑞）上市。临床研究发现，Crizotinib作为治疗ALK阳性非小细胞肺癌的一线用药，比化疗药物的治疗效果更好，极大地改善了患者的生活质量，给患者带来了新的希望。Crizotinib是一种MET/ALK/ROS1多靶点的药物。辉瑞公司研发Crizotinib的初衷是靶向c-Met，而临床实验却发现Crizotinib对c-Met引起的肿瘤患者没有明确的响应，反而对ALK和ROS1阳性的NSCLC具有好的响应。虽然目前有许多c-Met抑制剂处于临床研究阶段，但一直没有一个选择性的c-Met抑制剂上市，这使研究人员对c-Met靶点的成药性提出了疑虑。 由于PET探针可以快速准确的反应探针分子在体内的分布和生物学特征，因此可以通过靶向c-Met的PET探针来研究c-Met靶点的成药性特征。目前临床上c-Met靶向性的PET探针主要是通过放射性元素（89Zr、64Cu、11C、18F、125I及99mTc等）标记的生物大分子，有关小分子c-Met探针的报道很少，而小分子c-Met探针具有分子量小，透膜性好，能够直接与激酶区结合等优势。 因此，论文首先设计新的c-Met小分子PET探针来研究c-Met的成药性。基于我们组前期发展的喹啉类c-Met小分子抑制剂4-1b，通过在哌嗪部位引入18F放射性标记，得到PET探针5-21。探针5-21在小鼠血清和体内都具有很好的稳定性。探针分子5-21的体内PET/CT成像结果表明其能够特异性地结合到c-Met并在肿瘤部分有明显的吸收。体内组织分布数据发现，探针5-21在肝、肾及肠道中的吸收量要高于肿瘤部位的吸收，在肺、脾、胰腺、胃等器官中吸收量也比较高，表明c-Met抑制剂在体内的组织选择性比较差，可能存在潜在的毒副作用，为后续研究选择性的ALK抑制剂提供了指导意见，选择性ALK抑制剂可能具有更高的安全性。 临床发现，肿瘤患者在服用Crizotinib一年后，往往会出现耐药情况并且病情迅猛复发。引起Crizotinib耐药的原因复杂多样，总体可以分为ALK基因扩增、ALK蛋白激酶区发生二级突变以及旁路激活，其中二级突变引起的耐药约占三分之一。临床上发现的引起Crizotinib耐药的二级突变大概有二十几中，包括常见的L1196M、V1180L、G1269A、F1174L、1151Tins、C1156Y、G1202R、S1206Y等突变，其中“门控残基”L1196M突变所占的比例最高。为了解决L1196M突变耐药问题，自2014到2017年间，先后有三个ALK二代抑制剂被美国FDA批准上市，分别为Ceritinib、Alectinib和Brigatinib，其中Ceritinib和Brigatinib是氨基嘧啶类结构，Alectinib是四环骨架类结构。虽然这三个化合物比Crizotinib表现出更好的治疗效果并且能够解决许多二级突变引起的耐药，尤其是L1196M突变，但在未上市前就已出现耐药情况，其中比较突出的耐药突变是G1202R突变。G120R突变是目前ALK抑制剂最难克服的耐药突变，临床上针对G1202R突变比较有效的是辉瑞公司第三代ALK抑制剂Lorlatinib，目前正在申请上市。即使不断有新的ALK抑制剂面世，耐药问题依然如影随行。 针对第二代ALK抑制剂出现的G1202R突变耐药问题，我们从课题组前期开发的氨基嘧啶类二代ALK抑制剂4-2出发，首先对4-2与ALKG1202R突变蛋白的结合模式进行模拟，发现化合物4-2中的甘氨酸侧链由于位于苯胺的间位，距离氨基酸Arg1202稍远，且甘氨酸是个柔性侧链，因此氨基酸Arg1202与侧链甘氨酸的位阻作用要小。同时我们还发现在结合口袋的溶剂区域，存在许多极性氨基酸残基，如天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)及精氨酸(Arg)等。因此，我们考虑通过在甘氨酸链上引入适当的基团来增加与这些极性氨基酸的相互作用，从而提高化合物与ALKG1202R突变蛋白的结合力。我们在甘氨酸末端通过酰胺键引入间二苯酚片段后得到了化合物6-40a，其对ALK激酶的活性明显高于化合物4-2(0.8nM vs2.7nM)，对ALK依赖的H3122细胞活性有稍微提高(84nM vs97nM)。为了进一步提高其细胞活性，我们以6-40a为“hit”化合物，进行构效分析(SAR)和优化，最终得到化合物6-40d，其对野生型ALK激酶IC50值为1.7nM，对ALKL1196M和ALKG1202R突变的酶活分别为3.5nM和1.8nM;对BaF3/ALK-L1196M和BaF3/ALK-G1202R突变细胞的活性都小于1.5nM。化合物6-40d不仅提高了对L1196M和G1202R突变的活性，而且改善了原化合物4-2的hERG毒性(hERG IC50＞40μM)，但遗憾的是该化合物的PK性质和体内活性不好。 虽然临床试验发现第三代ALK抑制剂Lorlatinib对G1202R突变具有治疗效果，但其自身也无法避免耐药的出现。此外，Lorlatinib并不能解决由于ALK基因扩增或旁路激活引起的耐药。热休克蛋白90(heat shock protein90，Hsp90)是一种重要的分子伴侣，能够维持细胞内稳态，在信号传导、蛋白转运、受体成熟及免疫等方面都发挥着重要作用。在众多Hsp90“客户蛋白”中，酪氨酸激酶约占60％，许多酪氨酸激酶都是肿瘤驱动蛋白，如EGFR、ALK、c-Met等。抑制Hsp90会使这些致癌蛋白降解，这为解决ALK耐药问题提供了一条新的途径。有研究表明，Hsp90抑制剂不仅能够克服各种机制引起的ALK耐药，而且与ALK抑制剂联合用药比单独用药效果更好。为了避免联合用药存在的剂量和药物相互作用问题，我们设计合成了一系列ALK/Hsp90双靶抑制剂，并对其克服ALK耐药进行研究。 我们从化合物4-2和曾进入临床Ⅱ期的Hsp90抑制剂AUY-922出发，首先分析了这两个化合物与各自靶点蛋白的结合模式，发现4-2中氨基嘧啶母核与铰链区残基Met1199形成两个氢键相互作用，甘氨酸侧链位于溶剂口袋前沿区域并向外伸，具有较大的修饰空间。AUY-922分子中的间二苯酚和异嗯唑片段与氨基酸Asp93和周围的水分子形成一个紧密的氢键网络，乙酰氨片段和吗啉环伸向溶剂区域，在这两个位点修饰对活性影响较小。基于对两个化合物结合模式的分析，我们尝试将化合物4-2的甘氨酸片段分别与AUY-922的乙酰胺和吗啉片段通过合适的连接链相连，最终发现只有在吗啉环位点进行结合才能同时保证化合物对ALK和Hsp90两者的活性，并得到化合物7-24h。化合物7-24h其对ALK酶活的IC50值为17.3nM，对ALKL1196M突变的酶活IC50值为6.2nM，对Hsp90α蛋白的活性是100nM，对H3122细胞活性为11nM。为了寻找活性更好的双靶抑制剂，我们考虑将这一策略应用到另一个处于临床Ⅱ期的Hsp90抑制剂AT-13387中。在AT-13387的哌嗪部位引入化合物4-2，最终发现化合物7-24j的活性最好，对ALK激酶的活性能够达到9.8nM，对ALKL1196M突变酶活为6.0nM，对Hsp90α的酶活为40nM，对H3122细胞活性为13nM。化合物7-24h和7-24j都能够降解“客户蛋白”ALK水平，并下调下游信号分子AKT和ERK的磷酸化水平，同时上调Hsp70水平。能够降解ALK蛋白是这类ALK抑制剂不同于临床上抑制剂的根本特点，它能够解决由于ALK基因扩增和突变引起的耐药问题。此外，由于这类ALK抑制剂同时对Hsp90具有抑制作用，能够降解其它致癌蛋白，如EGFR和C-MET等，为解决由于旁路激活引起的ALK抑制剂耐药提供了可能，然而化合物的PK和体内活性较差，限制了其进一步应用。 靶蛋白降解(TPD)技术最直接的结果就是使靶标蛋白发生降解。通过直接降解ALK蛋白不仅可以达到抗肿瘤的效果，还可以从根源上解决ALK耐药问题。目前研究较多的靶蛋白降解技术是蛋白水解靶向嵌合分子（Proteolysis-targeting chimeric molecules，PROTACs），它是通过泛素-蛋白酶体系统(UPS)使蛋白降解，从而实现抑制靶蛋白功能。我们分别从E3连接酶CRBN和VHL的配体出发，通过聚乙二醇链连接不同的ALK抑制剂，设计合成了一系列靶向ALK蛋白的PROTAC分子，这些分子对ALK激酶具有抑制作用，但从初步WB实验中并没有发现这些PROTAC分子会引起ALK蛋白的降解。