【摘 要】
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该文首先建立了LF的两种测定方法:免疫酶联吸附测定法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC).以BALB/c鼠为免疫对象,以50μg/只为免疫剂量,成功制备了特异性强、效价高于1:204,800的
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该文首先建立了LF的两种测定方法:免疫酶联吸附测定法(ELISA)和高效液相色谱法(HPLC).以BALB/c鼠为免疫对象,以50μg/只为免疫剂量,成功制备了特异性强、效价高于1:204,800的LF抗血清.通过对初乳理化性质的研究,确定以72h内分泌的初乳作为研究对象.首先采用酶法沉淀酪蛋白,用囊式微滤器去除细小颗粒.采用板式膜组件和改良的醋酸纤维素膜材料,以错流方式操作的超滤系统,分别选用MWCO为150kDa和10kDa的超滤膜进行两步超滤.在中试规模研究了离子交换色谱技术纯化LF的色谱条件.选用的SP Sepharose Fast Flow离子交换剂对LF有很好的吸附选择性,洗脱速度可达到2L/h,可以满足中试生产的需求.以pH值为7.7~8.0,10mmol/L的磷酸盐为起始缓冲液,通过改变离子强度进行分步洗脱.经离子交换色谱分步洗脱,LF与LP达到了完全分离.经SDS-PAGE测定,LP显示为单一区带,相对分子质量为75,035Da.LP酶活回收率为76.17﹪.LP的最适pH为5.0~5.5,最适温度为55℃.在70℃、75℃时LP酶活的热失活曲线呈现一般植物过氧化物酶失活的双相特征.自制LF样品的铁结合能力为87.7﹪,铁饱和度为15.1﹪.当pH值为7.5,NaHCO<,3>浓度为100mmol/L时,铁结合能力最强.采用纸强度的巴氏杀菌可以保持LF的铁结合性能.SD大鼠的动物试验表明,50μg/(g·d)和250μg/(g·d)的LF剂量具有显著的升高血红蛋白浓度的作用.LF改善贫血的最小有效作用剂量为50μg/(g·d).探讨了铁饱和度影响LF抑菌性能的机理.圆二色性分析表明,随着铁饱和度的增加,LF的二级结构发生了变化, α-螺旋构象逐步转变为β-折叠构象,蛋白质分子排列更为有序,分子的结构变得更加紧密.当铁离子进入LF的铁结合位点,LF两叶环状结构闭合,铁结合能力下降,因此抑菌性能下降.差示扫描量热法研究进一步表明,LF的N-叶和C-叶铁结合能力不同造成热稳定性差异,低铁饱和度时较高的抑菌性能主要来自于C-叶.
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