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为了摸清广东省鸽毛滴虫的感染状况及流行规律,2006年4~5月间采用直接镜检法对广东省省内12家鸽场1739只鸽子进行了抽检,检出带虫鸽1167只,带虫率67.1%,其中乳鸽、青年鸽、产蛋鸽的带虫率分别为75.1%、71.7%、51.7%,与2003年调查的结果(65.8%、75.5%、70.2%、51%)无显著差异(p>0.05),乳鸽与产蛋鸽的带虫率呈正相关。将鸽毛滴虫经过人工培养扩增后,离心稀释后涂片,自然干燥、分别用福尔马林、甲醇、乙醇和火焰等5种方法固定虫体,对活体及固定片分别用瑞氏染液、吉姆萨染液、伊红溶液、碘酒等进行染色。结果表明:甲醇固定效果最好;活体染色以伊红效果最好,滴虫形态完整,结构清晰,虫体呈浅紫红色在溶液里游走,容易辨认;涂片时虫体密度以1~2×106个/mL最好;固定片染色的效果均不理想。将鸽毛滴虫人工培养扩增后,以甘油和二甲基亚砜作为保护剂,在不同温度下进行保虫试验,结果甘油与二甲基亚砜的保虫效果差异不显著(p>0.05);常温(18~25℃)下保存,鸽毛滴虫存活不超过8h;低温(-4℃)冷冻保存,可保存24h;-20℃下可保存5d,-80℃下可以保存1个月;液氮(-196℃)保存效果最好,半年后复苏,毛滴虫仍然存活,虽然活力下降,但对鸽子仍然有感染力,而且可以进行人工扩大培养。
将纯化的鸽IgG加入佐剂免疫兔,制备纯化的兔抗鸽IgG抗体;采用简易过碘酸钠法标记兔抗鸽IgG,制备兔抗鸽IgG-HRP;同时将鸽毛滴虫用超声波破碎后加入佐剂多次免疫健康鸽获取鸽抗鸽毛滴虫高免血清;然后在2×106个/mL鸽毛滴虫的抗原量下,用不同浓度的鸽毛滴虫高免血清和IgG-HRP进行Dot-ELISA试验,确定其最佳工作浓度,然后对70个临床样品进行检测。结果在2×106个/mL的鸽毛滴虫抗原量下,鸽抗鸽毛滴虫高免血清与兔抗鸽IgG-HRP最佳工作浓度分别为1:100、1:500;对70个样品进行检测,48个镜检为阳性的样品中用Dot-ELISA检测有44个呈阳性,阳性符合率为91.7%;22个镜检为阴性样品用Dot-ELISA检测有12个呈阴性,阴性符合率为54.5%;Dot-ELISA.检测的结果与镜检的结果总符合率为80%。另外,为了研制间接ELISA检测鸽毛滴虫抗体的方法,包被的鸽毛滴虫抗原密度为5×105个/mL,阳性血清以1:400倍稀释,兔抗鸽IgG-HRP工作浓度为1:500,将病原学检测阳性的72份青年鸽血清和阴性的45份青年鸽血清,用间接ELISA方法分别检测,其相对灵敏度为100%,而特异性为86.67%,准确率为94.87%。本试验成功制备了兔抗鸽IgG-HRP,建立了两种ELISA检测方法,即Dot-ELISA定性检测鸽毛滴虫抗原的方法和间接ELISA检测鸽毛滴虫抗体的方法。提取鸽毛滴虫的总RNA,逆转录合成第一链cDNA,通过RT-PCR扩增目的片段,并将其克隆到载体pMD18-T后,分别进行PCR和酶切鉴定,最后将PCR和酶切为阳性的克隆进行测序,将所得基因序列与GenBank中相应的核甘酸序列进行同源性分析比较。结果:RT-PCR扩增产物经电泳鉴定,大小约930 bp,与预期结果一致;将重组质粒分别通过PCR和酶切鉴定,结果表明成功构建了重组质粒pMD18-ap。对阳性克隆测序并分析,结果显示该基因长1032 bp,内含一个长930 bp的完整阅读框,能编码309个氨基酸,与阴道毛滴虫黏附蛋白(ap)基因ap33-1、ap33-2、ap33-3分别具有94.2%、87.3%和87.9%的相似性。可见成功克隆出T.g ap印基因序列,为进一步研究该基因的原核表达、真核表达及其重组蛋白的大量制备奠定了基础。
将T.g ap基因克隆至大肠杆菌表达载体pET-43.1a(+),获得插入了ap基因的重组质粒pET-43-ap,将质粒pET-43-ap转化到表达菌BL21,然后用IPTG进行诱导,将诱导后的表达菌离心,超声波裂解后,收集可溶性蛋白并经SDS-PAGE电泳检测,可溶性融合蛋白大小约为97KDa;并且发现在6h之内诱导表达的外源蛋白表达量随着时间的增加而增加,最高表达量占细菌总蛋白浓度的40.1%。Western-blot结果表明,T.g ap基因在大肠杆菌中的表达产物可以与相应的抗体反应,在约97 kDa处有特异性条带,表明重组T.g ap具有很好的免疫原性。
将T.g ap基因片段和表达载体pcDNA6/HisTM A经过EcoR I与Xba I双酶切后,用T4DNA连接酶连接,再将连接产物转化到大肠杆菌DH5a,以菌液为模板进行PCR鉴定,抽提PCR鉴定阳性菌液的质粒,对其作酶切鉴定,将鉴定为阳性的克隆进行测序并与T.g ap基因序列比对,获得了表达T.g ap蛋白的重组质粒pcDNA6-ap。
将鸽毛滴虫全虫疫苗、插入了T.g ap基因的大肠杆菌表达质粒pET43-ap印诱导的重组蛋白疫苗以及T.g ap真核表达质粒免疫鸽子后,鸽子均能产生很好的保护力。用间接ELISA检测试验鸽的抗体水平,三种免疫接种物均能产生抗鸽毛滴虫抗体,尤其是加佐剂的重组蛋白疫苗产生的抗体水平最高;通过部分血液生化指标的测定,推测它们对鸽内脏的影响不大。可见本次研制的鸽毛滴虫全虫疫苗、T.g ap重组蛋白疫苗以及T.g ap真核表达质粒均具有一定的免疫保护效果和良好的安全性。