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参考己发表的鸡IFN-γ和IL-15基因序列,设计合成引物,其两端分别增加了限制性内切酶Ncol和XhoI的识别位点,应用RT-PCR技术从刀豆球蛋白A(ConA)活化的岭南黄鸡脾淋巴细胞中克隆鸡IFN-γ和IL-15与pMD18-T载体相连构建重组质粒酶切后定向亚克隆到带有6个组氨酸标签的表达载体pET32a(+)中,构建重组质粒pET32a-IL-15、pET32a-IFN-γ,对其测序确认读框正确后,转入大肠杆菌Origami(DE3)中诱导表达并进行纯化,重组鸡白介素15(rChIL-15)融合蛋白在大肠杆菌中得到了成功表达并且主要以包涵体形式出现,其分子量约为32 kDa,扫描分析含量在30%左右。重组鸡γ干扰素(rChIFN-γ)融合蛋白在大肠杆菌中表达率较高,且大部分呈可溶性表达,目的蛋白在破菌后上清液中占总蛋白比可达到46%。由于两个重组的融合蛋白都带有6×His标签,我们采用Ni<2+>螯合柱亲和层析一肠激酶酶切一Ni<2+>鳌合柱亲和层析一凝胶过滤纯化步骤,最终可得到较高纯度的目的蛋白IFN-γ和IL-15。IFN-γ蛋白经MTT法检测,具有较好的抗病毒生物学活性。
以SYBR Green Ⅰ作染料beta-actin作内参,建立检测免疫活化基因表达的荧光定量检测方法;用建立的方法检测IFN-γ试验组、IL-15试验组免疫活化基因MHC-Ⅱ、MHC-Ⅰ、IL-10、IL-2R、CD3、CD4.和CD8 mRNA的表达水平,并与对照组的对应指标进行统计学分析。
试验结果通过统计分析,IFN-γ试验组和IL-15试验组P<0.05显示差别有统计学意义。对活化基因在试验组和对照组中的相对表达分析,分析结果发现:在IFN-γ试验组中MHC-Ⅰ在试验组/对照组表达比值为1.18。MHC-Ⅱ在试验组/对照组表达比值为1.86,IL-2R在试验组/对照组表达比值为1.95,IL-10在试验组/对照组表达比值为0.17,提示试验组中MHC-Ⅱ、IL-2R表达明显高于正常对照组细胞,而IL-10表达明显低于正常对照组细胞仅为对照组的0.17。表明IFN-γ能通过诱导淋巴细胞表达MHC-Ⅰ类和MHC-Ⅱ类分子来增强免疫应答,促进Th0向Th1的分化,IFN-γ抑制IL-10细胞因子的产生从而抑制Th2细胞的增殖,同时能诱导细胞表达IL-2受体,从而促进T细胞增殖,进一步增强免疫应答。
在IL-15试验组中CD3在试验组/对照组表达比值为1.93,CD4在试验组/对照组表达比值为2.19,CD8在试验组/对照组表达比值为1.4。表明IL-15能有效促进ConA激活的外周血CD4<+>T细胞和CD8<+>T细胞增殖。
试验鸡在接种H5亚型禽流感灭活疫苗和重组鸡IFN-γ蛋白后第7、14、21天检测到HI抗体分别为3.2 log2、4.4 log2和5.6 log2,H5亚型灭活疫苗和重组鸡IL-15蛋白后第7、14、21天检测到HI抗体分别为3-3 log2、4.1log2和5.3 log2,比单独H5亚型禽流感灭活疫苗免疫的HI抗体滴度有较大差异。在接种鸡新城疫活疫苗(LaSota,系)和重组鸡:IFN-γ蛋白后第第7、14、21天检测到HI抗体分别为2.7 log2、5.1log2和5.4 log2,鸡新城疫活疫苗(La Sota系)和重组鸡IL-15蛋白后第7、14、21天检测到HI抗体分别为2.9 log2、7.6 log2和6.4 log2,比单独鸡新城疫活疫苗(La Sota系)的HI抗体滴度差异显著。重组鸡IFN-γ和重组鸡IL-15有增强特异抗体表达的趋势,表现出较好的佐剂效应。