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脑卒中等中枢损伤导致神经细胞死亡、组织破坏、神经功能永久性缺失,是长期困扰生物医学界的一大难题,目前尚无有效治疗方法。中枢神经损伤难以修复的原因是神经细胞难以分裂增殖,并在损伤区域产生大量抑制神经再生因素,包括血管网缺失、胶质瘢痕形成、神经营养因子缺失、再生抑制因子产生等。组织工程学技术不仅可以通过生物材料为神经细胞和神经纤维生长提供结构支持,同时还能释放各种有利于神经再生修复的活性因子,有望在促进中枢神经损伤组织修复的同时,实现神经功能重建,为脑卒中等损伤再生修复带来希望。本研究拟在我们前期利用透明质酸水凝胶活性生物材料携带胚胎来源神经干细胞治疗大鼠脑梗塞的工作基础上,为进一步改善有利于神经再生的血管支持位环境,拟继续改进材料,制备透明质酸水凝胶为材料支架,添加分别载有促血管生成活性因子VEGF、Ang-1的PLGA控释微球,并在水凝胶材料上氧化接枝法连接NgR抗体,制备一种可促进血管生成、模拟脑内微环境、适宜损伤神经元生存和移植干细胞生存分化的新组织工程材料。并在此基础上,移植带有荧光蛋白标记的神经干细胞和骨髓基质干细胞,应用于脑梗塞模型小鼠进行研究,探讨其替代受损神经细胞、修复损伤脑组织、改善动物模型感觉运动功能的可能性。应用组织工程结合干细胞技术来探索修复脑组织损伤修复新途径。 本实验制备了复合PLGA的透明质酸水凝胶材料,利用扫描电镜技术观察了PLGA控释微球及透明质酸水凝胶材料形态,BCA法观察了PLGA控释微球体外释放因子规律,红外光谱验证了NgR抗体与透明质酸水凝胶的连接。移植入正常小鼠皮层后观察与脑组织融合,HE染色可见大量细胞迁移至复合PLGA的透明质酸水凝胶内生长,Niss1染色可见复合PLGA的透明质酸水凝胶内有大量神经元迁移生长。免疫组织化学法可看到小胶质细胞阳性反应极低,并且没有星形胶质细胞聚集,说明透明质酸水凝胶具有良好的生物相容性,良好的降解性和吸水性,抗原性低,并有桥接抗体的作用。本实验观察了人脐动脉内皮细胞在体外透明质酸水凝胶材料上的粘附生长,通过细胞计数,与单纯透明质酸水凝胶比较,复合PLGA的透明质酸水凝胶具有更强的促进内皮细胞增殖作用(P＜0.05)。我们纯化培养了神经干细胞和骨髓基质干细胞,可看到两种干细胞在透明质酸水凝胶材料上生长增殖,但复合PLGA的透明质酸水凝胶与单纯透明质酸水凝胶比较,两组材料上培养的干细胞增殖无统计学差异。体内部分,本实验还采用电凝右侧大脑中动脉制备脑梗塞模型小鼠,进行行为学比较、TTC染色、直接取脑观察的方法评价模型制备成功。为比较透明质酸水凝胶和复合PLGA的透明质酸水凝胶两种材料的促血管生成作用,我们分组将两种材料移植入脑组织梗死缺损区,发现复合PLGA的透明质酸水凝胶具有更强的促血管生成的作用,并明显改善小鼠前肢运动能力。在复合PLGA的透明质酸水凝胶,分组移植入神经干细胞和骨髓基质干细胞,发现可长时间促进干细胞存活。 复合PLGA的透明质酸水凝胶应能通过缓释VEGF、Ang-1因子,促进脑梗塞缺损区血管生成,进而营造适合干细胞生存微环境,为干细胞增殖分化提供有效条件,更有利于移植干细胞替代死亡神经细胞,为脑卒中等中枢神经损伤修复提供理论和实验依据。