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Bt毒素是由苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)产生的一种伴孢晶体,对鞘翅目、鳞翅目、双翅目昆虫的幼虫具有特异的杀灭活性,而对人及其他动物无害。Bt不仅可以作为喷射的微生物杀虫刹,还可以通过转基因技术导入到植物中高效特异地杀灭害虫,现已广泛应用于农林业害虫的防治。但随着Bt植物的大面积种植,对目标昆虫造成了极高的选择压力,使昆虫的抗药性不断增强,严重影响了该新型生物杀虫刹的使用效率。对昆虫抗性机制的研究是设计抗药性治理策略的基础,也是Bt植物持续应用于农林业生产中的根本保障。鳞翅目昆虫分布范围极广,且多数种类的幼虫为害各类栽培植物,是农林害虫最多的一个目。家蚕(Bombyx mori)是鳞翅目中的模式昆虫,具有极高的经济价值和丰富的种质资源,在生物学研究中发挥着重要作用。本研究以家蚕作为鳞翅目昆虫模型,研究其对微生物杀虫剂苏云金芽胞杆菌(Bt)毒素Cry1Ac的抗性水平及遗传特性及抗性相关基因,从分子生物学的角度解释了家蚕对Bt毒素Cry1Ac产生抗性的机理,为鳞翅目害虫对Bt毒素的抗药性治理提供参考。其主要实验研究内容及结果如下:1.品种间的抵抗力差异将Cry1Ac毒素蛋白分别给供试的100个家蚕品种的2龄起蚕添食,调查幼虫死亡率并计算LC50值。调查结果显示家蚕不同品种对Cry1Ac毒素的抵抗力差异很大,呈现多态性。2.家蚕对Bt毒素Cry1Ac的抗性遗传分析选取抗性亲本ACR1、敏感性亲本Nistari进行单蛾区杂交,构建正、反交F1代、F2代,及BC1代群体,对各群体抗性调查统计结果显示,家蚕对Cry1Ac毒素的抗性属于单基因控制的隐性遗传。3.家蚕对Bt毒素Cry1Ac抗性基因的连锁定位分析以两个亲本及F1的基因组DNA为模板,在28个家蚕连锁群上筛选多态标记。将筛选出的多态标记在亲本及后代群体中进行基因型分析,结果显示在第15连锁群上筛选到的多态标记,在BC1F中的带型与表型一致,说明抗性基因与15号连锁群连锁。用BC1M个体的300个个体确定与家蚕对Bt毒素Cry1Ac抗性基因连锁的多态性标记顺序和遗传距离,绘制出家蚕抗Cry1Ac基因的分子连锁图,其遗传距离为2.0 cM。4.家蚕对Bt毒素Cry1Ac抗性基因的初步预测及克隆测序根据分子遗传连锁图的定位区域预测目的基因为BGIBMGA007792-93,根据家蚕转运蛋白基因BGIBMGA007792-93的CDS全长序列(GeneBank accession no.AB620075.1)设计引物,以家蚕中肠cDNA为模板进行扩增,克隆测序得到抗性品种ACR1及敏感品种Nistari的cDNA序列。比对结果显示抗性品种ACR1序列中插入了三个连续的核苷酸,产生了一个酪氨酸插入。另外5个抗性的品种的氨基酸序列也同样插入了一个酪氨酸,但另外3个敏感品种的序列未发生单个酪氨酸插入,说明此酪氨酸的插入可能是引起家蚕对Cry1Ac毒素产生抗性的根本原因。5.家蚕对Bt毒素Cry1Ac抗性基因的功能验证通过CRISPR/Cas9系统介导的基因组编辑技术在敏感亲本Nistari体内干扰BGIBMGA007792-93基因的表达后,Nistari也对Cry1Ac毒素产生了抗性,说明BGIBMGA007792-93确实是造成家蚕对Cry1Ac产生抗性的关键基因。