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松材线虫病是一种由松材线虫引起的林业毁灭性病害,在我国多个省市严重发生,造成了巨大经济损失。迄今为止,国内外对松材线虫病开展了大量的研究,但针对松材线虫本身的基础性研究相对薄弱。HOX基因是一类进化保守的发育调控基因家族,在动物的胚胎发育和器官形成过程中具有重要的轴向调控作用。lin-39基因是松材线虫HOX基因家族的五个成员之一,研究松材线虫lin-39基因的表达特性和调控功能,有助于揭示松材线虫的个体发育调控机制,为进一步探索特异性的松材线虫病防控措施提供基础。为此,本研究对松材线虫lin-39基因的表达调控开展了系统研究,应用生物信息学分析该基因启动子保守的结构域motifs,预测编码区蛋白功能结构域,构建lin-39基因在多种生物之间的进化树;应用mRNA原位杂交和转基因荧光标记技术分析其时空表达特性,实时定量PCR展示其在个体发育的动态表达;采用RNAi技术及行为学测定,进一步验证该基因在松材线虫个体发育中的调控功能。研究结果如下:1、启动子分析结果表明,松材线虫与秀丽隐杆线虫共享3个保守且排列顺序相同的motifs,显示lin-39基因在线虫个体发育过程中调控机制的保守性。蛋白结构预测结果显示,lin-39是含有保守同源结构域的转录因子,进一步通过蛋白序列比对,发现即使在线虫分支内部,保守区域也仅限于同源结构域,表明高度保守的HOX基因在不同线虫种类之间也存在较大的差异;进化树分析结果表明,lin-39基因能够很好地反应线虫内部不同种类之间的亲缘关系。2、应用mRNA原位杂交技术,明确了lin-39基因在松材线虫的不同发育时期和不同性别个体上的时空动态表达,即胚胎期的表达部位为身体的中前部,J3期的表达部位为身体中后部,成虫期在雌虫阴户和雄虫交合刺尖端表达,但J2和J4期均未见其表达。3、首次采用转基因显微注射技术分析了松材线虫lin-39在秀丽隐杆线虫中的表达特性研究。应用in-fusion克隆技术,将松材线虫lin-39的启动子区域或全长区域包括启动子、内含子和外显子插入到m Cherry报告基因上游,构建表达载体,再将上述表达载体注射到秀丽隐杆线虫的性腺,观察其在蛋白水平上的动态表达,并与mRNA水平的原位杂交结果进行比较,进一步确认了松材线虫lin-39的动态表达特性。4、通过荧光实时定量PCR技术分析了lin-39基因在松材线虫不同发育时期的动态表达,发现lin-39基因在松材线虫胚胎期的表达量较高,其次是幼虫期,成虫期的表达量相对较低,不同发育阶段的表达差异达显著水平。这表明lin-39基因对松材线虫早期胚胎发育的躯体定位和轴向发育具有重要的调控作用,并在胚胎期和幼虫期完成对晚期器官(如阴户等)发育的调控作用。5、采用RNAi干扰技术,明确了lin-39基因对松材线虫不同发育时期的调控作用。在胚胎期,lin-39基因被干扰之后会引起胚胎畸形,卵的孵化率明显下降,只有±2.5%,显著低于对照±95%的孵化率;在J2早期,lin-39基因被干扰之后会导致雌虫阴户发育明显滞后;在J3期和J4期,均未见显著表型差异。行为学测定结果表明,在J2早期和J4期,lin-39基因被干扰之后会导致松材线虫交配时间缩短,交配次数增加,但产卵量和卵孵化率均无明显变化。