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肠出血性大肠杆菌(Enterohaemorrhagic Escherichia coli,EHEC)是重要的人兽共患病原菌,O157:H7是EHEC重要的致病血清型,能够在全世界范围内引起动物、家禽和人类爆发感染,导致严重的公共卫生问题。牛、羊等反鍵动物是O157:H7的主要储存宿主,感染并不发病,多为无症状带菌,通过排泄物污染水源、食物和环境,继而导致人类感染。人感染EHEC O157:H7引起轻微的自限性腹泻,严重时可导致出血性肠炎,甚至会引发更严重的并发症---溶血性尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome,HUS),最终导致病人的死亡,儿童和老人为易感人群。目前,市场上尚无预防O157:H7感染的可用疫苗制剂,对牛肉、牛奶等易污染食品的早期检测就成为预防疾病的重要途径,因此快速、灵敏、特异的检测技术亟待研制。EHEC O157:H7对人和动物的感染性和致病性有着明显不同,致病机制不明。Z3276 是 EHEC O157:H7 特异的开放阅读框(open reading frame,ORF)。BLAST分析显示,Z3276核苷酸序列只存在于EHEC O157:H7基因组,而氨基酸序列与其他大肠杆菌I型菌毛高度同源,但Z3276蛋白在EHEC O157:H7致病中的功能尚不明确。I型菌毛是很多革兰氏阴性菌共有的毒力因子,它能够促进病原菌对特定组织的黏附,并参与激活炎症信号通路。因此,研究内容主要包括以下3各方面:1.EHEC O57:H7z3276基因的原核表达以O157:H7基因组DNA为模板,PCR扩增去除信号肽z3276基因序列,构建原核表达载体 pCold I-z3276,成功表达 EHEC O157:H7 Z3276 蛋白,经 Western blot 方法检测具有良好的抗原性。这为后期O157:H723276基因缺失株的鉴定和部分特性研究提供了基础。2.EHEC O157:H7z3276基因缺失株的构建及生物学特性的研究以O157:H7基因组DNA为模板,分别扩增z3276基因343 bp和407 bp的上下游同源臂,扩增811 bp整个Gm表达盒,与pMEG375载体连接构建自杀性质粒pMEG375△Z3276,通过同源重组获得疑似缺失菌株,经PCR和Western blot鉴定,成功获得z3276基因缺失株O157:H7(△z3276),并对其与亲本株的生物学特性和致病性进行比较研究。结果表明,细菌增殖特性,相比EHEC O157:H7亲本株(WT)和互补株(C△z3276),培养4 h进入对数生长期,而O157:H7(△z3276)培养12 h才进入对数生长期,生长早期增殖明显变慢;动力学显示,在半固体Minca和TSB培养基,O157:H7(△z3276)移动半径分别是10mm和9 mm,而亲本株移动半径分别是14 mm和15 mm;在生物膜形成实试验中,O157:H7(△z3276)在Minca和TSB培养基中的吸光度分别为WT的68.6%和86.1%,生物膜形成能力明显减弱;O157:H7(△z3276)在不同时间点的自凝集率也低于WT;O157:H7(△z3276)对非肠源细胞Hep-2的黏附和侵袭力无显著变化,但是对肠源细胞IPEC-J2细胞的侵袭明显减弱;黏附抑制试验表明Z3276蛋白抗血清可抑制WT对Hep-2和IPEC-J2细胞的黏附;对小鼠致病性,WT 的 LD50= 108.9 CFU/只,而 O157:H7(△z3276)的 LD50= 109 5 CFU/只,降低4倍,粪便排菌实验同样显示,O157:H7(△z3276)排菌量和排菌持续时间减少和缩短。所有研究表明,EHEC O157:H7的遗传标志性基因功能体现在对病原菌生长特性、动力学、生物膜形成能力、自凝集能力、对IPEC-J2细胞的侵袭能力以及小鼠的致病多个方面。3.z3276-PCR方法的研制根据O157:H7 86-24菌株的z3276基因序列设计特异性引物,目的片段预期大小为608bp,对反应体系和反应条件优化,成功建立了检测O157:H7的特异PCR方法,并运用该方法检测200份牛肛拭子,检出23份阳性样品,分离得到23株0157:H7。特异性试验表明仅O157:H7菌株可以扩增出目的条带。退火温度为60℃。对O157:H7纯培养物的敏感度为1 CFU,模拟阳性临床样本的敏感度为10 CFU。该方法的建立为检测临床样本中可能存在的O157:H7提供了一种特异、敏感、快速的手段,有助于O157:H7感染的防控。