梅毒螺旋体鞭毛蛋白B的优势诊断肽段筛选与鉴定

• 作 者: 谭满意
• 出 处: 南华大学
• 发表日期: 2018年01期
• 关键词: 梅毒螺旋体 梅毒 FlaB肽段 血清学诊断

目的:构建、表达、鉴定和纯化梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)鞭毛蛋白B(Fla B1,Fla B2,Fla B3)的不同肽段,用间接Ig G ELISA评估各肽段的血清学诊断应用价值,筛选出灵敏度高且特异性强的优势肽段。方法:从Gen Bank中获取Tp的Fla B1、Fla B2和Fla B3的氨基酸序列,用BLAST分析Tp Fla B与其他病原体的鞭毛蛋白的同源性,将3种全长Fla B分为保守的N端、C端及中间可变区M肽段。设计9种Fla B肽段的特异性引物,以相应全长Fla B的重组质粒为DNA模板,PCR扩增各肽段的基因片段,构建p ET28a(+)原核表达载体,经测序鉴定后转化至E.coli BL21(DE3)中,IPTG诱导各重组肽段表达,Western Blot鉴定表达产物,Ni2+-NTA亲和层析柱纯化重组肽段,透析法复性,BCA法测定肽段浓度。建立基于重组Fla B肽段的ELISA,检测各期梅毒患者血清、健康人血清和交叉血清中的特异性Ig G,并将其与TPPA进行比较,初步评价9种肽段的血清学诊断应用价值。结果:成功构建9种Fla B肽段的重组质粒,经测序鉴定证实插入的基因片段均为各肽段的目的基因序列。9种Fla B肽段的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)表达菌后,IPTG诱导表达相应分子量的重组蛋白,Western Blot鉴定表达的蛋白均为目的肽段。可溶性分析结果表明各重组肽段均为包涵体表达。Ni2+-NTA亲和层析柱纯化各重组肽段的效果较好。ELISA结果显示所有肽段检测临床血清Ig G的灵敏度均较好(91.1%~95.0%),其中Fla B3的M肽段(B3M)的灵敏度高达95%且各肽段间的灵敏度差异不具有统计学意义(P>0.05);N端和C端检测临床血清Ig G的特异度较差(64.1%~78.4%),而3个中间肽段B1M、B2M和B3M检测Ig G的特异度分别为96.1%、94.8%和100%。B3M与其他肽段间的特异度差异具有统计学意义(P<0.05)。因此,B3M即为所筛选的优势肽段。结论:重组肽段B3M具有较好的免疫反应性,检测临床血清的灵敏度和特异度分别为95%和100%,其为所筛选的优势肽段。