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LMNA(Lamin A/C)基因被定位于1号染色体1q21～22,其可变性RNA加工(alternative RNA spicing)的拼接产物即为lamin A和lamin C。lamin A、C包括一个具备α螺旋的中心二聚体功能域(centralα-helical dimerization domain)和两侧的氨基端头部、羧基端尾部。Lamin A、C蛋白的氨基端首566个氨基酸是相同的,这包括了氨基端头部、中心二聚体功能域和大部分尾部。它们通过中心柱区域交联成二聚体,与核膜内侧的镶嵌蛋白相互作用。因此与细胞核的组织形态密切相关,特别在细胞分裂间期DNA复制时对维持染色质的组织、细胞核的正常形态(核膜孔的空间排布,核膜的锚定)有重要的意义:提示它们与RNA剪切、细胞分化、调亡和对细胞核形态的细胞周期依赖性调控等行为密切相关。
迄今以来,已有超过180种LMNA基因突变被确认与超过10种单基因遗传疾病(临床综合征)相关。所有这些与LMNA基因相关的疾病(临床综合征)因此被命名为laminopathy。脂肪萎缩性糖尿病并下颌骨肢端发育不全症(mandibuloacral dysplasia,MAD,OMIM248370)是脂肪萎缩性糖尿病的一种亚型；同时办被归类于laminopathy。MAD是一种很少见的单基因遗传病,以下颌骨发育异常、肢端骨质溶解、脂肪分布异常、严重胰岛素抵抗、早老为主要的临床表现。
Laminopathy属于一类异质性极强的遗传性疾病,累及多种组织。这些的病变组织的共同特点是它们均来源于中胚层,包括:骨骼、骨骼肌、心肌、皮肤、脂肪组织、神经组织；受累组织表现为发育不良和/或加速的退行性变。在多种laminopathy中,作为组织加速退行性变的代表,早老的表型可见于哈-格二氏早老综合征(Hutchinson—Gilford progeria syndrome,HGPS)、MAD和Dunnigan型家族性部分性脂肪萎缩症(familial partial lipodystrophy of the Dunnigan type,FPLD)。遗憾的是,早老的机制至今仍未阐明。
同时见于HGPS、MAD和FPLD的类似细胞核畸形为lamin A/C可能与早老相关提供了证据。鉴于lamin A/C在维持基因组完整性、缺损DNA修复中的重要作用,可以推测lamin A/C与laminopathy患者的早老有一定的相关性。
基于本例MAD—like laminopathy患者突出的早老表型(白发、老龄化色素沉着、硬皮样皮肤改变)和早发肿瘤,研究本例MAD—like laminopathy患者的早老机制,有助于加深对lamin A/C的分子致病机制的了解。
LMNA敲除小鼠表现为细胞核结构异常、生存期缩短、早老等表型,显示了laminA/C在细胞核组织的重要性。除了在细胞核组装中的作用,许多与细胞分化、增殖相关的转录因子与lamin A/C均有密切的相互作用,例如视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein,pRb)。研究认为Rb是细胞周期阻滞的重要关隘。pRb是P53-p21-Rb通路的下游效应蛋白之一,因此,推测p53-p21-pRb通路异常可能是本例MAD-like laminopathy早老的分子机制。
一、研究目的：
就一临床拟诊为MAD-like laminopathy的病例进行临床诊断和鉴别诊断,完成候选基因筛查和分子病因学诊断。探讨本例MAD-like laminopathy患者早老的分子机制及lamin A/C缺陷对本例MAD—like laminopathy患者p53-p21-pRb通路的影响。
二、研究方法：
(一)收集详尽的临床资料,完成临床诊断与鉴别诊断。
原代培养患者及两名年龄匹配对照的皮肤成纤维细胞,分别在传代的早期、中期、晚期(P10、P15、P22)进行相关的试验。
(二)分子诊断
1、候选责任基因基因组水平、转录水平突变筛查
(1)候选责任基因(LMNA、ZMPSTE24、INSR、PPAR G、WRN)所有外显子、外显子-内含子交界区及5端非编码区双向测序
(2)LMNA基因cDNA双向测序,Northern blot、real-time PCR检测laminA、lamin C mRNA片段大小、丰度
2、Western blot检测laminA、lamin C蛋白质表达丰度
3、电镜检测成纤维细胞超微结构
4、成纤维细胞lamin A/C、emerin免疫荧光双染色
(三)早老的分子机制
1、免疫组化检测老化相关β半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)在成纤维细胞中的表达
2、成纤维细胞生长增殖能力检测
(1)成纤维细胞生长曲线
(2)MTT检测成纤维细胞生长活性
(3)检测成纤维细胞细胞周期
3、成纤维细胞凋亡率的检测
(1)Annexin—V and propidium iodide(PI)检测凋亡
(2)检测caspase-3活化程度
(3)TUNEL法检测凋亡细胞
4、p53-p21-pRb通路检测
(1)实时荧光PCR检测成纤维细胞p53、p21、pRb基因表达
(2)Western blot检测p53、pRb
三、结果：
(一)本例患者临床诊断为MAD-like laminopathy。
(二)本例MAD-like laminopathy患者的分子病因
1、候选责任基因基因组水平、转录水平突变筛查
(1)候选责任基因(LMNA、ZMPSTE24、INSR、PPAR G、WRN)所有外显子、外显子-内含子交界区及5端非编码区双向测序未发现碱基突变。
(2)LMNA基因cDNA双向测序未发现碱基突变。Northern blot检测laminA、lamin C mRNA片段所处位置与理论值相符、丰度与对照相比无明显上调或下调。Real-time PCR检测lamin A、lamin C mRNA丰度与对照相比无明显改变。
2、Western blot检测lamin A、lamin C蛋白质表达丰度
患者成纤维细胞lamin A表达丰度与对照相比基本一致；而lamin C表达丰度与对照相比明显减低。用图像处理软件BandScan V5.0测量成像X光胶片感光区带的感光密度值,患者的lamin C表达明显减弱,为对照的7.15±1.59％,(p<0.05)。
3、电镜检测成纤维细胞超微结构
对照成纤维细胞在传代过程中保持着长椭圆形的细胞核形态、边缘光滑,核孔正常分布,异染色质在核膜内侧呈放射状分布；患者成纤维细胞在P10即表现出细胞核超微结构明显异常(芽苞样分叶,异染色质消失,核孔形态异常)；且异常程度随着传代次数增加而加重。患者P22细胞细胞核明显分叶,可观察到部分细胞有“肿瘤细胞”样的核小袋形成；电镜下可观察到细胞核浓集固缩的典型凋亡细胞；可见多核细胞；部分细胞碎裂、细胞器难以分辨。
4、成纤维细胞lamin A/C、emerin免疫荧光双染色
对照成纤维细胞核呈规则卵圆形,lamin A/C与emerin在核膜上均匀分布。患者成纤维细胞核呈现多种畸形:细胞核大小不一,部分细胞核呈巨大圆形；细胞核呈芽苞样突起,在芽苞样突起部位可见lamin A/C与emerin分布不均；甚至可见“泪滴”样细胞核；lamin A/C、emerin在表达不均质,部分细胞核可见laminA/C、emerin在核浆内形成致密的、强荧光颗粒；部分细胞核可见lamin A/C、emerin在细胞核失表达而错位表达在细胞浆。患者细胞畸形细胞核高达30.5±2.8％,而对照只有1±0.3％且比例与细胞传代代数无关；患者细胞畸形核比例随着细胞传代代数增加而升高,在P10、P15、P22细胞中分别为30.5±2.8％、40.2±3.9％、60.8±3.5％。
(三)本例MAD-like laminopathy患者早老的分子机制
1、SA-β-Gal在成纤维细胞中的表达
对照成纤维细胞在P22的SA-β-Gal免疫组化染色仍为阴性。患者细胞在P10的SA-β—Gal免疫组化染色已呈现阳性,在光学显微镜下表现为鲜艳的蓝色；随着传代代数增加,患者细胞SA-β-Gal免疫组化染色阳性率明显增加,着色加深。
2、成纤维细胞生长增殖能力检测
(1)成纤维细胞生长曲线
患者成纤维细胞生长曲线较对照明显低平,且随着传代次数增加,曲线更趋低平,与对照有统计学差异(p<0.05)。
(2)MTT检测成纤维细胞生长活性
患者成纤维细胞生长活性较对照明显减低,随着传代次数增加,患者细胞生长活性明显下降,与对照相比有显著性差异(p<0.05)。
(3)检测成纤维细胞细胞周期
对照与患者P10成纤维细胞G1/G0期细胞比例分别为87.7±0.4％,79.4Ⅴ2.7％;S期细胞比例分别为6.6±0.2％,11.3±2.2％；G2/M期细胞比例分别为5.7±0.2％,9.3±0.4％；差异有统计学意义(p<0.05)。患者与对照P15成纤维细胞G1/G0期细胞比例分别为89.9±1.4％,75.6±1.7％；S期细胞比例分别为4.2±0.2％,14.9±1.9％；G2/M期细胞比例分别为5.8±1.4％,9.3±0.4％；差异有统计学意义(p<0.05)。患者与对照P10成纤维细胞G1/G0期细胞比例分别为85.3±0.6％,68±1.5％；S期细胞比例分别为2.9±0.3％,23.3±1.6％；G2/M期细胞比例分别为11.6±0.3％,8.7±0.1％；差异有统计学意义(p<0.05)。
3、成纤维细胞凋亡率的检测
(1)Annexin—V and propidium iodide(PI)检测凋亡
对照和患者P10成纤维细胞在基础状态的凋亡比例分别为3.15±0.14％,3.8±0.15％；在400μM的H2O2处理24小时后,对照和患者细胞被诱导凋亡的比例分别为5.6±0.21％,6.93±0.08％,差异有统计学差异(p<0.05)。对照和患者P15成纤维细胞在基础状态的凋亡比例分别为5.4±0.2％,7.3±0.2％；在400μM的H2O2处理24小时后,对照和患者细胞被诱导凋亡的比例分别为7.12±0.26％,11.6±0.36％,差异有统计学差异(p<0.05)。对照和患者P22成纤维细胞在基础状态的凋亡比例分别为6.16±0.22％,40.6±1.65％,差异有统计学差异(p<0.05)。
(2)检测caspase-3活化程度
接受400μM的H2O2处理24小时后,患者成纤维细胞Caspase-3活化程度较对照明显增加,有统计学差异(p<0.05)；且随着代数增加而加重。
(3)TUNEL法检测凋亡细胞
对照成纤维细胞直至P22可见极个别TUNEL染色阳性的凋亡细胞；在400μM的H2O2处理24小时后,TUNEL染色阳性细胞稍增加。患者细胞在P22即可见较多TUNEL染色阳性细胞；在400μM的H2O2处理24小时后,TUNEL,染色阳性细胞明显增加。
4、p53-p21-pRb通路检测
(1)实时荧光PCR检测成纤维细胞p53、p21、pRb基因表达
患者p53mRNA表达丰度比对照相比调；p21、pRb的mRNA表达丰度与对照相比无统计学差异。
(2)Western blot检测p53、pRb
患者成纤维细胞p53表达丰度比对照明显增加,且随着传代次数增加而增加。患者成纤维细胞pRb表达丰度比对照明显减弱,且随着传代次数增加而更加减弱。
四、结论：
1、本研究从蛋白质水平、亚细胞水平、细胞水平及临床水平明确了患者MAD-like laminopathy的诊断。
2、Lamin C缺陷与本例MAD-like laminopathy相关,是本例MAD-likelaminopathy的分子病因。
3、Laminopathy是一连续性的疾病谱而非各自独立的疾病实体。
4、Laminopathy不仅与遗传相关,也可能与其他因素有关。
5、在哺乳动物细胞中,lamin C相对lamin A更为重要。
6、Lamin C缺陷直接导致pRb稳定性下降。
7、Lamin C缺陷可能通过未知的途径直接激活p53通路。
8、Lamin C缺陷导致的患者细胞染色质/DNA稳定性下降可能是p53通路激活的标志之一。
9、p53通路激活介导了细胞高凋亡率、对凋亡诱导敏感性增加,细胞加速凋亡和细胞净生长增殖能力下降。
10、Lamin C缺陷对p53通路的直接激活和pRb稳定性下降的共同结果是细胞的加速老化。这是本例MAD-like laminopathy患者老化的分子机制。