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本文以谷氨酸棒杆菌S9114(Corynebacterium glutamicum S9114)为出发菌株,根据发酵代谢调控理论进行诱变选育L-组氨酸产生菌。主要研究内容和结果如下:
①确立了定量分析发酵液中L-组氨酸的“Paully标准加入法”。以经硫酸锌预处理(以锌离子屏蔽L广组氨酸咪唑基的PauUy反应)的谷氨酸棒杆菌S914发酵液为空白,以Paullv法绘制标准加入曲线,其线性回归方程:y=12.036x+0.0075,相关系数:R2=0.9989。该法可减小发酵液中钙离子、镁离子、氨离子等对Paully法的干扰,且保持了Paullv法定量分析L-组氨酸简单、快速的优点;
②以浊度法测定菌悬液浓度。结合平板菌落计数,以生理盐水为空白,在620nm波长绘制菌悬液浓度标准曲线,其线性回归方程:y=0.3448x一0.0043,相关系数R2=0.9992;同时确定了前培养周期为12h、种子培养周期为12h;
③以谷氨酸棒杆菌S9114为出发菌株,经亚硝酸钠诱变、6-巯基嘌呤平板初筛,选育出一株L-组氨酸产生菌Y1,该菌株可积累L组氨酸248mg/L;谷氨酸棒杆菌S9114经紫外线与氯化锂复合诱变、6.巯基嘌呤平板初筛,选育出一株L-组氨酸产生菌LF11,该菌株可积累L-组氨酸257mg/L;
④以含2%甘氨酸的液体完全培养基将谷氨酸棒杆菌LFll预培养至对数生长期、6.7U/mL青霉素钠预处理2h、2000U/ml,蛋清溶菌酶处理12h,原生质体制备率为98.90%:以含0.5mol/L蔗糖的等渗完全培养基平板再生,再生率为10.67%;
⑤根据浅盘发酵的原理自行设计出双层平皿初筛。与摇瓶发酵复筛相比,前者耗时少、培养基用量少;经对比,突变株L广组氨酸积累能力排序的平皿初筛与摇瓶复筛结果相吻合,且在平皿初筛中也未见染菌现象;
⑥原生质体的制备和再生有诱变效应。以谷氨酸棒杆菌LFll为出发菌株,经再生诱变,筛选低浓度6-巯基嘌呤、D-组氨酸、4-硫尿嘧啶抗性突变株,得到菌株LYl,该菌株可积累L组氨酸265mg/L:
⑦以谷氨酸棒杆菌LFll为出发菌株制备原生质体并进行多次诱变,逐级引入并筛选高浓度6-巯基嘌呤(MP)、D-组氨酸(DH)、4.硫尿嘧啶(4-AU)和1,2,4.三噻唑-3-丙氨酸(TRA)抗性突变株,最终选育出一株L-组氨酸产生菌UN26221(Mpr+DHr+4-Aur+TRAr),该菌株在未经发酵条件优化时可积累L-组氨酸2093mg/L