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鸡痘是危害养鸡业发展的一种重要传染病,发病后成鸡一般不造成死亡,雏鸡死亡率较高,5％～30%不等,黏膜型鸡痘症状较严重,有时可引起较高的死亡率。鸡痘可使病禽牛长迟缓,产蛋下降,种禽发病时孵化率降低,若并发其他传染病、寄生虫病和卫生条件、营养状况不良时也可引起大批死亡,死亡率甚至高达40%～50%。
目前,世界各国对鸡痘的预防主要是接种鸡痘或鸽痘病毒弱毒活疫苗,在很大程度上降低了鸡痘的发牛率。但近些年来,鸡痘的发牛率又有增高的趋势,并且症状也比以前的严重,免疫失败的情况也很常见。目前市场上现有的鸡痘疫苗的种类较少,其中大部分为鸡胚尿囊膜或鸡胚组织弱毒疫苗,此种疫苗有明显的缺点,如生产成本高,安全性较低等。为了丰富鸡痘弱毒疫苗种类,本研究通过将FPV-DHN毒株作为备用疫苗毒株,进行克隆纯化,验证其作为疫苗种毒株的可能性,并通过实验筛选疫苗种子毒的代数,进一步评定此次研究的鸡痘弱毒疫苗的性能。
本研究通过将FPV-DHN毒株在CEF细胞上传代,让其适应在CEF细胞上增殖,在适应CEF细胞增殖后,通过3代蚀斑克隆纯化,获得高纯度的FPV-DHN毒株,将蚀斑纯化后的FPV-DHN命名为F1代毒株,再将F1代毒株通过CEF细胞盲传,获得不同代数的毒株,通过测量每一代毒株的病毒滴度,结果显示FPV-DHN毒株在CEF细胞上的适应性良好,增殖滴度稳定,并且通过传代FPV-DHN毒株在细胞上的滴度逐渐提高,在传至20代病毒滴度稳定在105.75TCID50/0.1ml左右。
为本研究提供可靠的检测手段。根据NCBI已发表的鸡痘病毒4b基因的序列,在4b基因上设定一条特异性的引物,通过对反应条件的优化,建立了一个敏感性较高、特异性好的检测方法,通过对临床样品的检测,证明此方法可以应用于临床,同时也为鸡痘弱毒疫苗的研制提供了检测方法。
为了获得更准确的检测手段,同样在FPV4b基因上设计一对引物和TaqMan探针,建立鸡痘病毒荧光定量PCR检测方法,通过对反应条件的优化,建立了一个敏感性高,特异性好,重复性好的检测方法,其定量方程式为:Cr=-2.81gCopynμmber+38.49通过将CT值代入方程式可定量样品中模板的含量;通过对临床样品的检测,证明此方法与普通PCR方法相比有更高的敏感性,可用于临床样品的检测,同样也为疫苗的研制和质量检验提供了更敏感的检测方法。
通过初步动物试验初步筛选,初步证明FPV-DHN毒株的免疫原性并没有随病毒的传代而极具下降,对毒株的筛选主要的考虑因素为病毒的滴度和传代的稳定性,结合以上结果,筛选F16、F17、18二代毒株作为种子毒生产一批半成品疫苗,通过动物试验检测疫苗的安全性、最适免疫剂量、最小免疫剂量及疫苗对鸡群生长的影响,并通过二次攻毒试验检测疫苗的免疫有效性,研究证明,本研究筛选的鸡痘弱毒疫苗的安全性高,对未免疫鸡群不存在水平传播,高剂量免疫鸡群不存在发病现象,通过检测该疫苗病毒在机体内的存在部位和消长规律,进一步检验了疫苗的安全性;结果显示,最适免疫剂量为将疫苗稀释为病毒含量为104～105STCID50/0.1ml能完全保护强度株的攻击;最小免疫剂量为将疫苗稀释至病毒含量102TCID50/0.1ml。通过对免疫后未攻毒鸡群进行定期称重,显示疫苗对鸡群的增重无明显影响,适用于种鸡群,同样适用于肉鸡群。