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目的:观察使用温敏型生物降解水凝胶PLGA-PEG-PLGA作为载体的防龋基因疫苗 pVAX1-spap/A、 pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT经股四头肌注射、口服、颌下腺周注射和鼻腔黏膜滴注四种途径免疫新西兰大白兔后，诱导特异性抗体的产生和重组质粒在免疫部位的原位表达情况，探索以水凝胶作为缓释载体条件下的最佳免疫途。()
方法:本实验包括两部分:
实验一:利用质粒纯化试剂盒大量抽提重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gt fB/CAT以及空载体质粒pVAX1:抽提之前首先小提pVAX1-spap/A、pVAX1-gt fB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT以及空载体质粒pVAX1，经限制性内切酶以及凝胶电泳鉴定正确后再行大量提取;大量提取后利用紫外分光光度计测定所抽提质粒的OD值，并计算质粒浓度及纯度，贮存以备免疫动物使用。
实验二:温敏型生物降解水凝胶PLGA-PEG-PLGA作为载体的重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gt fB/CAT、pVAX1-spap/A-gt fB/CAT以及空载体质粒pVAX1免疫新西兰大白兔。新西兰大白兔60只，随机抽取48只分为三个大组作为实验组，每组16只，再随机分为四个小组，每小组4只，分别为股四头肌注射组、口服组、颌下腺周注射组和鼻腔黏膜滴注组;三个大组分别为以温敏型水凝胶作为载体的重组质粒pVAX1-spap/A组，以温敏型水凝胶作为载体的重组质粒pVAX1-gtfB/CAT组和以温敏型水凝胶作为载体的重组质粒pVAX1-spap/A-gtfB/CAT组。另外12只作为对照组，随机分为三组，每组4只，分别为空载体PVAX1质粒股四头肌注射组;空载体PVAX1+水凝胶口服组和生理盐水股四头肌注射组。每只新西兰大白兔按照确定的途径进行免疫，每只的剂量为200μg，股四头肌注射组、鼻腔黏膜滴注组及颌下腺周注射组每侧为100μg，共免疫三次，分别于第一次免疫后间隔一周加强免疫二次，再间隔一周加强免疫第二次;分别于免疫前一天和免疫后第1，2，3，4，6，8，10，12，14，16周采集动物血液及唾液标本，并利用酶联免疫吸附试验（间接ELISA法）测定血清及唾液中特异性抗体IgG和S-IgA的水平。第三次免疫后第三天每小组处死一只动物，取注射部位股四头肌、颌下腺、鼻腔黏膜，口服组取小肠黏膜，常规固定、包埋，5μm连续切片，免疫组织化学SP法染色。第16周采集完血液和唾液标本后处死动物，称重，解剖分离心，肝，脾，肺，肾等脏器进行病理检查，观察各器官大体形态及组织结构有无异常变化。
结果:①使用宏量质粒纯化试剂盒抽提出高纯度、高浓度的重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gt fB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT以及空载体质粒PVAX1。②以温敏型生物降解水凝胶PLGA-PEG-PLGA作为载体的重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT免疫新西兰大白兔后，可以诱导特异性IgG和S-IgA抗体的产生，并且抗体水平明显升高并持续数周。③实验组中，股四头肌注射组注射部位的股四头肌，颌下腺周注射组的颌下腺，鼻腔黏膜滴注组的鼻黏膜以及口服组的小肠黏膜均检查到了目的蛋白的表达。④各实验组动物体重和重要脏器的病理切片均未检测到明显病理变化，未发现重组质粒pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT对新西兰大白兔产生明显毒性作用。
结论:①利用温敏型生物降解水凝胶作为载体的防龋基因疫苗pVAX1-spap/A、pVAX1-gtfB/CAT、pVAX1-spap/A-gtfB/CAT可以诱导新西兰大白兔唾液和血清中特异性抗体的产生。②以上重组质粒对动物一般安全性无明显影响。