论文部分内容阅读
生物节律广泛存在于生物界,从原核单细胞到高等动植物,包括人类的生命活动都在生物钟控制下进行。生物钟系统由授时信号输入通道、核心振荡器和信号输出通道组成。细胞和组织虽然脱离了生物体中枢神经的调控,但是其内部的外周生物钟也具有内源性节律。昆虫的许多生理活动和行为如孵化、羽化、取食、代谢、交配产卵、眠起,甚至免疫和学习记忆等都表现出一定的生物节律。光照作为昆虫最重要的授时因子,在果蝇等模式昆虫中其输入途径和反馈环路的研究已经非常深入,但是温度授时因子的作用机制还没有得到阐明,其重要的原因是缺乏有效的生物模型。本文在基于光授时因子信号环路的基础上,利用qRT-PCR、Western blotting、免疫荧光等实验技术手段,研究了家蚕BmN细胞生物钟基因Cry1、Cry2、Per、Tim以及相应的蛋白质,在不同的温度循环和高温刺激处理下节律振荡的表达特征。结果如下：1.家蚕生物钟蛋白的亚细胞定位在26℃、12hL:12hD条件下,家蚕BmN细胞中生物钟蛋白CRY1、CRY2、PER和TIM的表达能够响应光照刺激,并且对光照产生了节律振荡。蛋白质亚细胞定位结果显示,在12hL:12hD昼夜光振荡节律变化过程中,CRY1没有在细胞核出现,只存在于细胞质中；CRY2稳定存在于细胞质,但有少量入核；PER在细胞质和细胞核中都存在；而TIM光照时入核,黑暗时则从细胞核返回细胞质。推测CRY1是光信号受体,将刺激传递给CRY2、PER和TIM,三者可能进一步结合后进入细胞核发挥转录抑制作用,其中TIM可能在细胞质中还有负反馈信号作用。2.37℃瞬时高温刺激对家蚕BmN细胞生物钟基因表达的影响为了验证生物钟基因是否响应温度信号,用37℃瞬时高温刺激30min的处理方法,调查家蚕BmN细胞在瞬时高温刺激之后的48h中,光授时因子负反馈信号通路核心生物钟基因Cry1、Cry2、Per和Tim的表达情况。结果表明,37℃瞬时高温刺激能够诱导了BmN细胞内生物钟基因表达的节律振荡,表现为表达量增加以及波动性增强,其中Cry1、Cry2和Per基因的表达量振幅变化显著,只有Tim没有发生显著变化。Cry2进一步表现出相位前移与振荡周期变长,而Cry1表现出振荡周期变短。推测Cryl和Cry2可能是温度授时因子响应的主要基因,Per基因的作用相对较弱,而Tim基因可能与温度授时因子的信号响应没有直接关系。3.温度节律处理下BmN细胞生物钟基因及其蛋白的表达特征在恒明、2℃振荡温度(12h26℃：12h28℃)节律下,束梅影(2013)的研究表明,生物钟基因Cry1、Cry2、Per和Tim的表达都发生节律振荡。本文进步使用Western blotting方法在蛋白质水平上的检测发现,只有CRY1蛋白质含量发生了节律振荡变化,而CRY2.PER和TIM都没有出现与基因表达量相符合的节律振荡。推测可能是2℃温差在不足以引起BmN细胞的生物钟蛋白水平对温度信号的响应。进一步在恒明、5℃振荡温度(12h20℃:12h25℃或12h25℃:12h30℃)节律下调查发现,Cry1和Cry2的基因表达对温度变化响应敏感,而在恒暗5℃振荡温度节律下,Cry1和Per基因表达对温度变化响应敏感。推测光照的存在可能会影响温度的作用。在此基础上,选择在恒暗、10℃振荡温度(12h20℃:12h30℃)变化鉴定生物钟基因和蛋白对温度振荡变化的响应,结果观察到基因和蛋白的同步节律振荡变化,并观察到Cry1(CRY1)和Per(PER)对温度变化响应敏感,而Cry2(CRY2)响应稍弱,而Tim(TIM)则没有观察到变化。综合上述结果2和结果3,可以看到Cry1和Per基因对稳定的温度节律响应敏感,而Cry2可能对短时间高温响应更为敏感,推测Cry1可能在家蚕BmN细胞温度授时信号途径中是更为活跃的成员。