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阿尔茨海默病(Alzheimers disease，AD)是一种中枢神经系统退行性疾病，目前其相关研究主要在细胞和动物水平进行，但这两种实验水平均存在一定的局限性，细胞实验虽然易于操作，却无法模拟在体tau蛋白的多个异构体的同时表达，并且神经原纤维缠结和老年斑的形成不是单纯神经元的行为，而动物实验干扰因素多，不易于操作和控制，因此寻找并建立一个可靠易操作的研究平台具有重要意义。 AD的主要神经病理学特征之一是由异常过度磷酸化的微管相关蛋白tau组成的神经原纤维缠结，虽然关于tau蛋白的异常过度磷酸化和聚积形成神经原纤维缠结的研究已揭示了这一病理过程中的许多环节，但到目前为止，其具体发生、发展机制仍未阐明。本研究在器官型海马脑片水平应用蛋白磷酸酯酶PP-2A抑制剂冈田酸(Okadaic acid，OA)造成Alzheimer样蛋白磷酸酯酶缺陷，进一步探讨tau蛋白磷酸化的改变及其对tau蛋白功能的影响。在AD脑内存在蛋白酶小体活性下降，为探讨抑制蛋白酶小体对tau蛋白的影响，我们以Lactacystin抑制蛋白酶小体活性，研究内源性正常tau及OA诱导的过度磷酸化tau的降解。因为PHF能够抑制蛋白酶小体的活性，所以我们初步研究了异常过度磷酸化tau对蛋白酶小体活性的影响。主要结果如下: 第一部分 器官型海马脑片长期培养条件的探索以及tau蛋白的表达特性 一、温度对长期培养的器官型海马脑片活性和tau蛋白表达的影响 温度对海马脑片的细胞活性影响:34℃较37℃能在较长的时间内保持细胞活性，而在同一培养温度时，不同年龄鼠的脑片的细胞活性变化趋势一致;温度对海马脑片的tau蛋白表达的影响:成年鼠（4周和8周）的海马脑片tau蛋白在34℃时能维持较长时间的稳定表达，而在37℃时tau的表达量随培养时间的延长而显著下降，且随鼠龄的增加，这种影响越明显。温度对1周和2周龄乳鼠的海马脑片tau蛋白的表达无影响。34℃培养条件下，4周和8周龄大鼠制备的海马器官型脑片能更长时间维持脑片的活性和tau蛋白的稳定表达，从而可望成为研究与tau蛋白相关疾病（如AD）的理想模型。 二、不同培养基对长期培养的器官型海马脑片活性及tau蛋白表达的影响 在海马脑片的长期培养过程中，虽然两种培养基(1)50％ MEM+25％马血清+25％ Hanksbalanced salt solution(HBSS, pH7.2-7.4)+100 U/ml青霉素+100μg/ml链霉素+葡萄糖(6.5 g/l);(2) DMEM/F12+10％马血清+100 U/ml青霉素+100μg/ml链霉素）对脑片活性的影响无显著差别，但DMEM/F12可使脑片中的tau蛋白更持久、更高量地稳定表达，尤其是2和4周龄鼠源海马器官型脑片。因此，选取2周或4周龄大鼠，应用培养基DMEM/F12更适合于脑片水平tau蛋白的相关研究，在此基础上可望建立更理想的AD研究模型。 第二部分 在器官型海马脑片水平抑制蛋白磷酸酯酶对tau蛋白磷酸化及其功能的影响 一、抑制蛋白磷酸酯酶对器官型海马脑片tau蛋白磷酸化的影响 为进一步揭示蛋白磷酸酯酶PP-2A缺陷在tau蛋白异常过度磷酸化中的作用，为建立一个可操作性强的AD研究模型，我们在海马器官型脑片水平应用了PP-2A的特异性抑制剂OA。结果发现:与对照组相比，抑制蛋白磷酸酯酶PP-2A可引起tau蛋白在抗体tau-1表位显色减弱，pS262和R145d表位显色增强，提示tau蛋白在Ser198/Ser199/Ser202，Ser262和Ser422多个位点磷酸化增强。值得注意的是，与对照组相比，OA作用3hr，使tau蛋白PHF-1表位显色显著增强，并且出现条带上移，而在药物作用至6hr时，虽然仍可看到条带上移，但显色却明显减弱，甚至低于对照组，提示PP-2A的抑制除其本身直接影响tau蛋白的磷酸化外，可能还通过调节其他激酶的活性间接影响tau蛋白的磷酸化。 二、抑制蛋白磷酸酯酶对器官型海马脑片tau蛋白微管结合功能的影响 tau蛋白的生物学功能受其磷酸化调节，本实验用PP-2A抑制剂OA诱导tau蛋白在不同位点的磷酸化后，通过检测上清(游离tau)和沉淀（微管结合tau）中tau蛋白总量的变化来研究器官型海马脑片中tau蛋白的异常过度磷酸化是否影响tau蛋白微管结合力。结果显示:在0.5μM OA处理6 hr，处理组上清组分R134d显色比对照组增强，沉淀组分显色减弱，提示细胞内游离tau（上清）增加，微管结合tau（沉淀）减少，tau蛋白的异常过度磷酸化导致了tau与微管的结合力的下降。 第三部分 抑制蛋白酶小体活性对tau蛋白降解的影响 一、抑制蛋白酶小体活性对内源性磷酸化和非磷酸化tau蛋白降解的影响 在海马器官型脑片水平应用蛋白酶小体的特异性抑制剂Lactacystin抑制蛋白酶小体的活性，检测tau蛋白的降解是否受到影响，发现:与对照组比较，10μM Lactacystin处理后3 hr，抗体Tau-1免疫反应性显著增强，PHF-1免疫反应性显著减弱，提示在正常条件下(1)蛋白酶小体参与正常tau蛋白的降解;(2)蛋白酶小体对tau蛋白的降解可能存在一定的选择性，即主要降解非磷酸化tau蛋白，故抑制蛋白酶小体活性时导致非磷酸化tau蛋白聚积;(3)抑制蛋白酶小体活性可能激活了tau蛋白去磷酸化系统，从而导致tau蛋白去磷酸化作用增强;(4)抑制蛋白酶小体活性可能代偿性激活了其他蛋白水解酶(如calpain)系统，从而加速了内源性磷酸化tau蛋白的降解。 二、抑制蛋白酶小体活性对OA诱导的过度磷酸化tau蛋白降解的影响 为进一步探讨蛋白酶小体在降解异常磷酸化tau蛋白中的作用，我们在海马器官型脑片水平应用蛋白酶小体的特异性抑制剂Lactacystin抑制蛋白酶小体的活性后，应用蛋白磷酸酯酶PP-2A的抑制剂0A诱导tau蛋白的异常过度磷酸化，检测当蛋白酶小体的活性受抑时，异常过度磷酸化的tau蛋白的降解是否受到影响。免疫印迹结果显示:(1)两药物共处理组与OA组相比，pS262和R145d免疫反应性显著增强，提示当蛋白酶小体活性下降时，这两个位点磷酸化的tau蛋白降解减少，说明了蛋白酶小体在降解异常过度磷酸化tau蛋白中的作用;(2)两药物共处理组与OA组比，PHF-1显色减弱，提示蛋白酶小体可能在PHF-1表位磷酸化的tau的降解中不起主要作用，再次证实抑制蛋白酶小体活性可能代偿性激活了其他蛋白水解酶系统，从而加速了对PHF-1表位磷酸化的tau蛋白的降解。另外，Lactacystin单独处理组抗体pS262和R145d未见显色条带，提示10μMLactacystin处理海马器官型脑片可能不会影响tau的磷酸化（至少是在pS262和R145d位点），因此，上述Lactacystin引起磷酸化或去磷酸化tau的改变可能是影响tau降解所致; 三、OA处理器官型海马脑片对蛋白酶小体活性的影响 为了探讨tau蛋白异常磷酸化对蛋白酶小体活性的影响，我们进一步单用0.5μM OA处理器官型海马脑片，利用荧光底物Boc-Leu-Ser-Thr-Arg-AMC检测了胰蛋白酶样蛋白酶小体的活性。结果显示:与对照组相比，0.5μM OA处理3虹后，胰蛋白酶样蛋白酶小体活性显著降低，仅为对照组的50％，提示tau蛋白的异常过度磷酸化对蛋白酶小体活性有抑制作用，tau磷酸化、聚集和蛋白酶小体活性降低之间的相互作用可能在tau病变的发展中形成恶性循环。