盐芥胁迫相关基因的克隆及其功能分析

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干旱、高盐和低温是影响农作物生长和产量的最主要非生物胁迫因素。植物通过一系列生理和生化变化来适应环境胁迫。当植物受到非生物胁迫时,一系列不同功能的基因被诱导表达或抑制表达。这些基因可以分为两类。一类是功能蛋白基因,其编码产物直接保护植物细胞,抵御外界环境胁迫,如编码渗透压保护大分子(如脯氨酸、可溶性糖、甜菜碱等)合成关键酶的基因、晚期胚胎丰富蛋白基因等。另一类为调节基因,其编码产物调控非生物胁迫响应过程中基因表达和信号转导,如各种转录因子基因、蛋白激酶基因等。很多胁迫诱导基因会被多种胁迫诱导表达,它们参与的信号途径构成了一个网络,因此这些信号途径之间可能存在交叉对话。   CBF3是一类转录因子,主要参与调控冷胁迫途径,过表达该基因可以提高植物的耐冷性。CDPKs是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,参与多种信号传导途径,可以响应干旱、高盐和低温等胁迫条件。SRK2C也是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在拟南芥中可以显著提高其耐旱性。P5CS和GolS2分别是合成脯氨酸和棉子糖家族寡糖的关键酶,脯氨酸和棉子糖家族寡糖是渗透保护物质,可以提高植物的耐渗透胁迫能力。   已经有研究表明,在拟南芥中CBF3、CDPK6、GolS2、P5CS2、SRK2C这5个基因与植物抵御非生物胁迫有关。本实验以盐芥cDNA为模板,PCR扩增得到目的基因。连入克隆载体,经酶切鉴定正确后送测序。将测序结果在NCBI网站上与拟南芥的基因序列进行比对,发现盐芥CBF3、CDPK6和SRK2C三个基因的序列与拟南芥完全一致,GolS2的序列有一个碱基发生改变,但并未引起氨基酸的变化,而P5CS2序列中有一个碱基发生改变,导致第81位的丙氨酸变为缬氨酸,不过两者都属于脂肪族类氨基酸。通过多序列比对,对5个基因各设计两个RNAi结构,构建植物表达载体,转化拟南芥,获得转基因纯合植株。另外,每个基因筛选3个突变体进行同步实验。   在1/2 MS培养基上,大部分转基因植株和突变体的生长速度快于野生型植株。   不同ABA条件下,随着ABA浓度升高,种子萌发率下降,但是转基因、突变体和野生型没有明显差别。在2.0μM ABA条件下,幼苗的生长速度下降,叶片变黄,但是生长状态也无明显差别。   不同NaCl条件下,随着NaCl浓度升高,种子萌发率下降,转基因材料的种子萌发率低于野生型,其中CBF3和GolS2的转基因材料萌发率明显低于野生型。在100mM NaCl条件下,大部分转基因材料幼苗叶片比野生型黄,根长较短,其中CDPK6、GolS2和P5CS2的转基因材料受盐胁迫更加严重。   不同甘露醇条件下,随着廿露醇浓度升高,种子萌发率下降,转基因材料的种子萌发率低于野生型,其中CBF3和GolS2的转基因材料萌发率明显低于野生型。在200mM甘露醇条件下,大部分转基因材料幼苗叶片比野生型更小、更窄,根长较短,其中GolS2和P5CS2的转基因材料受甘露醇胁迫更加严重。   不同H2O2条件下,随着H2O2浓度升高,种子萌发率下降,但是转基因和野生型没有明显差别。   根据以上结果看出,这5个基因在植株对ABA或H2O2胁迫的响应中无明显作用,但CDPK6、GolS2和P5CS2对于盐胁迫抗性和渗透(干旱)胁迫抗性有重要作用。
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