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葡聚糖是豆粕、禾谷类常用动物饲料原料中的抗营养因子,也是制糖、啤酒工业的有害化学物,为了便于葡聚糖脱除方法的评价,实时监控制糖、啤酒加工过程葡聚糖的形成情况,建立一种快速、准确的葡聚糖定量检测方法十分必要。免疫分析法是根据抗体和抗原能发生特定结合而形成的分析方法,具有操作简单,灵敏度高,选择性强、不需要特殊仪器和设备等优点。本研究以研究葡聚糖免疫抗原的合成,多克隆抗体制备及免疫分析技术为基础,建立了一种快速简便的葡聚糖的酶联免疫检测(Elisa)方法。具体研究内容如下：
⑴合成了不同氧化度的氧化葡聚糖半抗原,经过红外光谱和紫外光谱鉴定合成产物:采用还原胺化法,合成了不同的葡聚糖-BAS(HSA)人工抗原,优化反应pH值、反应原料比、反应时间等反应条件,测定抗原的接枝度,SDS-PAGE对不同抗原进行定性与半定量表征;通过间接非竞争Elisa检测抗原与葡聚糖一抗结合的效果,结果表明:半抗原的氧化度,葡聚糖的分子量和空间结构,载体蛋白对葡聚糖-BSA(HSA)抗原与葡聚糖一抗结合的效果均有很大的影响。
⑵将葡聚糖与牛血清蛋白(BSA)以Maillard法合成葡聚糖-BSA抗原,抗原测定接枝度进行定量鉴定；通过间接非竞争Elisa检测Maillard法制备的抗原与葡聚糖一抗结合率,结果表明:反应48h后的T100-BSA与一抗的结合率最强,即Maillard产物与葡聚糖一抗的结合率不仅与糖的分子量有关,并且与糖本身的特性、糖与蛋白质结合产物的结构有关。
⑶通过免疫新西兰大白兔获得的多抗以及Elisa试验条件的优化,建立了葡聚糖免疫定量检测方法。最佳检测条件为:抗原包被浓度10μg/mL,37℃时血清多抗和酶标多抗的反应时间均为45min,5％小牛血清为封闭液；用间接竞争Elisa方法,检测不同分子量的葡聚糖对多抗的抑制。结果表明:不同分子量的葡聚糖均能对多抗血清产生抑制作用,且分子量越大的葡聚糖对多抗的抑制效果越明显；同时市售的白糖对多抗也有一定的抑制作用,经检测可知,当白糖中葡聚糖T40的浓度3.5μg/mL时即可通过此多抗检出。