B亚型禽偏肺病毒的分离鉴定及致病性研究

• 作 者: 于蒙蒙
• 机 构: 中国农业科学院
• 出 处: 中国农业科学院
• 发表日期: 2019年08期
• 关键词: 鸡 B亚型禽偏肺病毒 形态特征 全基因组测序 致病性

禽偏肺病毒（Avian Metapneumovrus，aMPV）的自然宿主是火鸡，其次是鸡。aMPV感染火鸡导致火鸡鼻气管炎（Turkey rhinotracheitis，TRT），引起火鸡严重的呼吸道疾病。aMPV感染鸡导致鸡的肿头综合症(Swollen head syndrome，SHS)，单一感染时死亡率较低（5％～10％），但引起产蛋量下降(10％～30％)，其更大的危害在于aMPV感染后，常继发其它细菌感染，引起严重的呼吸道症状，死亡率高达25％。目前，除大洋洲以外的世界各地均有该病的报道。中国首次在1999年分离到aMPV，随后流行病学调查表明，中国部分养殖场aMPV的感染率相当高，该病对中国养禽业的危害日益加重。由于aMPV分离非常困难，所以国内关于aMPV的分子生物学特征及致病性鲜有研究，不利于该病的有效防控。　　本研究将疑似肿头综合症的鸡的鼻甲骨和肺脏研磨后分别种于Vero细胞，盲传5代，观察到有一份接种鼻甲骨样品的Vero细胞变圆、聚堆形成合胞体，具有aMPV典型的细胞病变(CPE)特征，将其命名为LN16。电镜观察负染的LN16分离株的病毒粒子呈现多形性，直径约为50-200nm，偶见直径为500nm的病毒粒子，具有典型的副黏病毒的形态特征;亚型特异性的RT-PCR检测结果显示，LN16分离株仅扩增出了B亚型特异性条带;进一步扩增和测定了LN16分离株的G基因序列，分析表明其G基因与B亚型aMPV的同源性均高于93.8％，而与A、C和D亚型aMPV的同源性都低于63.7％;进一步利用B亚型aMPV特异性的阳性血清进行间接免疫荧光实验，结果显示感染LN16的Vero细胞有特异性的绿色荧光信号。综合以上结果，表明LN16分离株为B亚型aMPV。　　为了解LN16分离株的分子特征，设计合成了7对引物测定其全基因组序列。测序结果显示，LN16分离株基因组全长为13，513bp，编码9个蛋白。将其全基因组序列提交至GenBank(登陆号:MH745147)，该序列是第一个鸡源的B亚型aMPV的全基因组序列。与火鸡源B亚型aMPV分离株序列比较发现，LN16分离株的全基因组序列与火鸡源的同源性为97.6％，8个编码基因的同源性为95.1％-98.4％，相对保守，但基因间隔区出现碱基的插入和删除，存在明显差异。　　为了进一步评价LN16分离株对鸡的致病性，将LN16分别感染3、6、9和15周龄的SPF鸡。观察发现，感染后3-6d的SPF鸡均出现流鼻涕、甩头、流眼泪及精神萎靡等临床症状，各组的发病率均在70％及以上;感染后2-5d的SPF鸡出现排毒，第4d排毒率最高，达到83.6％;感染后的2-5d，在鼻甲骨、气管、喉头等上呼吸道组织中检测到病毒，偶尔也在免疫器官胸腺中检测到病毒;感染组SPF鸡的胸腺出血，鼻甲骨和肺脏出现炎症等病理变化。这些结果表明，LN16分离株对SPF鸡有明显的致病性。　　本研究成功地从发病鸡群中分离到一株B亚型aMPV，扩增获得首个鸡源B亚型aMPV的全基因组序列，该分离株对不同日龄的SPF鸡有明显的致病性，这些研究结果丰富了aMPV的流行病学资料，同时也为疫苗等防控产品的研制奠定了基础。