【摘 要】
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果胶酶是作用于果胶质的一类酶的总称,果胶酶的应用领域非常广泛,不仅可用于食品工业如果汁加工及果酒生产方面,还广泛应用于纺织脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物
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果胶酶是作用于果胶质的一类酶的总称,果胶酶的应用领域非常广泛,不仅可用于食品工业如果汁加工及果酒生产方面,还广泛应用于纺织脱胶、木材防腐、生物制浆、环境保护、污物软化处理和饲料添加剂等行业中。但是,果胶酶要实现有效的工业应用,要求其必须具有良好的酶学活性,除此之外,针对在不同领域的应用拥有相应的酶学性质。因此开发新的果胶酶,获得高产果胶酶的基因工程菌具有重要的意义。本文采用基因克隆的方法,从枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)中克隆到一个果胶酶基因,将所得到的基因分别在大肠杆菌和毕赤酵母中进行了表达,研究了重组酶的酶学性质,为果胶酶的有效应用奠定了基础,具体研究结果如下。
1.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果胶裂解酶基因pel的克隆和在大肠杆菌的表达。
通过PCR的方法从枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)168中克隆到一个果胶裂解酶基因pel,将该基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了表达。SDS-PAGE显示基因pel在大肠杆菌BL21(DE3)中表达出了分子量为46kDa一条蛋白带,与预测的氨基酸分子量46kDa相符。以0.5％聚半乳糖醛酸(PGA)为底物进行活性测试,重组果胶酶的最适反应pH是9.4.,在pH6.3-10之间保持60％以上活性,最适反应温度55℃,在60℃下处理30min仍能保持60％以上活性,5mmol/L的金属离子,大多数对该酶产生抑制作用,其中Zn2+能完全抑制该酶的活性;但Ca2+却对PEL的活性产生了极大的激活作用,与所报道的同类型其他果胶裂解酶文献结论相符。5％的DMSO,Tween-80,β-巯基乙醇,SDS分别使PEL的活性降低了5.59％,12.85％,29.66％,62.72％,而EDTA加入后,则能完全抑制该果胶裂解酶的活性。
2.枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)果胶裂解酶基因pel的克隆和在毕赤酵母的表达
将所克隆到的果胶酶基因pel在毕赤酵母GS115中进行了表达,转化子25℃摇瓶培养在第3天达到最高表达量26U/mL。重组果胶酶的最适反应温度是55℃,在65℃下处理30min保持75％以上活性。
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