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目的：
UhpA为伤寒沙门菌双组份调节系统的效应调节蛋白，在高渗应激下其基因表达明显上调。本研究的目的是进一步探讨伤寒沙门菌调节因子UhpA在高渗应激下对基因表达调节的影响。
方法：
(1)伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株制备：采用自杀质粒pGMB151介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌调节因子UhpA的基因缺陷变异株，根据伤寒沙门菌uhpA基因序列设计引物，扩增uhpA基因上、下游同源性片段，定向连接成uhpA基因缺损型同源核苷酸片段，并与自杀质粒pGMB151相连后经电击法导入伤寒沙门菌野生株，在5％蔗糖LB平板上进行同源重组，通过筛选获得uhpA基因缺陷变异株。
(2)伤寒沙门菌基因转录表达谱分析：利用伤寒沙门菌全基因组芯片分析技术，体外模拟高渗环境应激，在低渗(50 mM NaCl)LB培养液中分别培养伤寒沙门菌野生株和uhpA基因缺陷变异株4h(37℃，250r/min)至对数生长期，后转入高渗(300 mM NaCl)LB培养液中在同样条件下继续培养，在高渗应激30 min后，分别提取伤寒沙门菌野生株和uhpA基因缺陷变异株的总RNA，反转录成cDNA并标记荧光(cy3或cy5)，与基因组芯片杂交，扫描后据荧光信号分析各基因转录表达水平，比较伤寒沙门菌野生株和uhpA基因缺陷变异株在高渗应激下的基因表达谱差异。
(3)实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析：选择部分表达差异显著的基因，设计并合成特异性引物，进行实时荧光定量PCR，验证DNA芯片分析结果。
(4)UhpA蛋白表达纯化：根据伤寒沙门菌uhpA基因序列设计引物，扩增uhpA基因片段，与表达载体pET-22b连接经热击法转化入大肠杆菌JM109，用IPTG诱导表达UhpA蛋白，用镍柱按产品说明纯化UhpA蛋白。
(5)凝胶阻滞试验：根据伤寒沙门菌cysD基因以及treB基因序列设计引物，设计特异性引物扩增出cysD基因以及treB基因启动子区域。取1-2ug PCR产物与不同浓度的UhpA蛋白混合，加入相应体积的GSM缓冲液，使三者反应总体积为20 ul，30℃孵育15 min。选取198 bp的真核生物PCR产物作为阴性对照，8％的丙烯酰胺胶电泳分离条带，溴化乙锭染色。
结果：
(1)PCR及序列分析证实，uhpA基因缺陷变异株中uhpA基因297bp被6 bp取代，表明成功构建uhpA基因缺陷变异株。
(2)基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株在高渗应激下有21个基因表达下调。绝大多数下调基因与硫代谢相关。
(3)对uhpA基因缺陷变异株中表达差异基因(cysM, treB)，利用实时荧光定量PCR进行分析其mRNA水平，其结果与基因芯片分析结果基本一致。
(4)成功表达并纯化出UhpA蛋白，用于凝胶阻滞试验。
(5)选取uphA基因缺陷变异株中表达差异基因(cysD，treB)，凝胶阻滞试验的结果表明UhpA对treB，cysD等基因无直接调控作用。
结论：
成功构建伤寒沙门菌uphA基因缺陷变异株；UhpA在伤寒沙门菌高渗应激下对硫代谢基因表达调节发挥重要作用。