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家蚕是以卵态滞育的昆虫,其滞育性与养蚕生产密切相关。为从分子水平上研究、探索家蚕胚胎期的滞育、滞育解除和发育的生化代谢机制,本文利用蛋白质组学、生物信息学和分子生物学的技术方法,以家蚕932品种的滞育卵、非滞育卵和即时浸酸卵为材料,研究了胚胎发育过程中五种酶类的活性变化,筛查出与滞育关联的蛋白,成功克隆了6个基因,同时进一步探索了滞育卵经盐酸浸渍能解除滞育的机理。主要获得如下结果:
1、检测了滞育卵、非滞育卵和即时浸酸卵的胚胎在发育早期1～7d的SOD、CAT、PK、LDH和AChE的活力变化。在即时浸酸卵中,SOD、CAT、PK、AChE的活力随胚胎的发育而上升;LDH的活力则伴随着胚胎的发育经过而下降。在非滞育卵中,SOD、LDH的活力随发育而下降;CAT、PK、AChE的活力则随发育而上升。在滞育卵中,SOD、AChE的活力较稳定;CAT的活力随发育上升;LDH的活力随发育而下降,PK的活力在胚胎发育的前四天呈上升趋势,随后基本保持稳定。
2、通过SDS-PAGE电泳与MALDI-TOF-MS质谱联用的方法,对经浸酸处理活化后的胚胎的程序性发育蛋白进行了比较分析,选取了6条差异明显的特征性蛋白带作质谱鉴定,1、3、4号蛋白条带鉴定为卵黄磷蛋白,2、5号蛋白条带鉴定为卵特异蛋白。卵黄磷蛋白和卵特异蛋白在胚胎发育过程中发生明显的差异变化,可能因生理代谢需要而发生水解,成为胚胎发育的蛋白质源。
3、利用双向电泳结合ESI-MS质谱技术筛查到与滞育相关联的蛋白。在产后1～3d的滞育卵与非滞育卵的双向电泳图谱中,经ImageMasterTM2D Platinum 5.0软件分析,筛选出两个只出现在卵龄为3d的非滞育卵中的蛋白,经质谱鉴定为保幼激素结合蛋白(Jhbp)和30K脂蛋白。在即时浸酸卵与滞育卵的双向电泳图谱中,筛选出两个只出现在滞育卵中的蛋白,经质谱鉴定为磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)和α微管蛋白;同时还鉴定了一个化学感应蛋白7,该蛋白在即时浸酸卵中的表达量较滞育卵明显上调。
4、对双向电泳筛查到的保幼激素结合蛋白,经分析去除其序列中前18个氨基酸的信号肽序列,再构建该蛋白的原核表达载体进行重组蛋白表达。表达产物经纯化、脱盐、冷冻干燥后免疫雄性豚鼠制备抗体,分析保幼激素结合蛋白在胚胎发育早期的表达情况,结果在卵龄3d的非滞育卵中检测到该蛋白的表达,与双向电泳的分析结果相吻合。对该蛋白的基因在滞育卵及非滞育卵的胚胎发育过程中的转录表达情况做半定量分析,BmJhbp基因在非滞育卵的胚胎发育期基本保持相对稳定的转录表达,而在滞育卵中,当其从蛾体产下后经过72h已检测不到BmaJhbp基因的转录表达,同时内参基因BmactinA3在此后也检测不到转录表达。
5、应用shotgun混合蛋白鉴定技术,首次建立了卵龄1d的非滞育卵与滞育卵的蛋白质表达谱。在非滞育卵与滞育卵中,分别鉴定得到562种蛋白和501种蛋白,其中相同的蛋白有304种,分别占非滞育卵鉴定蛋白的54.09％和滞育卵鉴定蛋白的60.68％。非滞育卵的特异蛋白有258种,占其鉴定蛋白的45.91％。滞育卵的特异蛋白有197种,占其鉴定蛋白的39.32％。
在鉴定的所有蛋白中,等电点在4.0～7.0之间的占61.71％;7.0～8.0之间的占7.62％;8.0～10.0之间的占25.59％。分子量在15～60kDa之间的蛋白的占了60.87％。PI＞10.0的蛋白,在滞育卵中有25种,在非滞育卵中有29种,这些蛋白通常在双向电泳中很难能分离鉴定得到。
通过GO工具对鉴定的蛋白进行分类,在细胞定位分类中,位于细胞内的蛋白最多,位于细胞内的被膜的蛋白最少。在分子功能分类中,滞育卵与非滞育卵的注释蛋白大部分具有结合功能和催化活性。在生物学过程分类中,大部分注释蛋白参与代谢过程和细胞过程。在此基础上,筛选了5个候选基因进行克隆。其中BmnitA基因与滞育有关,只在滞育卵中鉴定到该蛋白的表达,其基因片段长度1176bp,Genbank登录号为GU354318;BmADK2、BmIDH、BmGGT基因与非滞育有关,仅在非滞育卵中鉴定到这三个蛋白的表达,BmADK2基因片段长度729bp,Genbank登录号为GU270853;BmIDH基因片段长度1167bp,Genbank登录号为GU270852;BmGGT基因片段长度1581bp,Genbank登录号为GU270851;对于Bmrcdl基因,在滞育卵与非滞育卵中均鉴定到该蛋白的表达,基因片段长度858bp,Genbank登录号为GU454861。
6、为更进一步了解家蚕滞育卵经浸酸处理能解除滞育的机理,通过扫描电镜对即时浸酸卵与滞育卵进行卵壳表面的扫描观察,发现滞育卵经浸酸处理后,卵壳表面出现较多裂痕现象。同时,通过SDS-PAGE电泳比较滞育卵、非滞育卵和即时浸酸卵的蛋白的差异变化,发现在滞育卵中存在的20kDa以下的小分子量蛋白组分,经浸酸处理后消失或表达量明显降低。利用shotgun技术对这类小分子量蛋白组分进行鉴定分析,在滞育卵与非滞育卵中得到5种卵壳蛋白(ErB.1、ErB.2、ErB.3、Hc-A和Hc-B),而在即时浸酸卵中却未能鉴定得到。据此认为,蚕卵经浸酸处理会引起这5种卵壳蛋白的消失。
7、利用生物信息学的方法和基因工程技术,以虐蚊同源基因为信息模板,成功克隆了家蚕细胞周期蛋白BmCcnll基因,其cDNA序列已登录到GenBank,登录号为:FJ889988。利用Protean软件分析BmCcnll蛋白的分子量为49kDa,等电点为9.84。同时,构建了BmCcnll基因的重组表达载体,对其进行重组表达,该重组表达的蛋白以包涵体形式存在。利用半定量RT-PCR技术分析了BmCcnll基因在胚胎发育过程中的转录表达,BmCcnll基因的mRNA在非滞育卵的胚胎发育阶段基本保持相对稳定的转录表达,而在滞育卵中,当其从蛾体产下后经过72h已经检测不到BmCcnll基因的mRNA的转录。