论文部分内容阅读
本研究用RT-PCR技术成功地从鸡传染性法氏囊病毒（IBDV）基因组中克隆出IBDV VP2基因，并实现了在大肠杆菌中的高效表达；以纯化的IBD VP2表达抗原为包被抗原，建立了可检测血清IBD抗体的ELISA方法，为传染性法氏囊病基因工程疫苗、快速诊断试剂的研究奠定了基础。 用蛋白酶K消化、酚-氯仿抽提法成功提取出IBDV基因组RNA，用RT-PCR技术扩增出IBDV的结构蛋白基因VP2，并将其克隆到pMD18-T载体。经序列测定，VP2基因全长1356bp，与GenBank中的IBDV超强毒株VP2基因序列同源性达97％以上；将VP2基因插入大肠杆菌原核表达载体pGEX-KG，获得重组质粒pKG-VP2，再转化入大肠杆菌BL21 plys S，经IPTG诱导，受体菌E．coli BL21（DE3）plys S能表达结构蛋白基因VP2，经SDS-PAGE及Western blot分析，表达产物分子量约40 KDa，表达量达到菌体总蛋白的10％，且能与IBDV阳性血清发生特异性的免疫反应。 以纯化的IBDV VP2表达蛋白作为包被抗原，建立了一种检测血清中IBDV抗体的间接ELISA方法。通过对ELISA反应条件的系列测定，确定了各组分的最适工作条件：IBDV VP2表达抗原最适包被浓度为105ng／孔；被检血清的最佳稀释度为1：80，达到该稀释度时的P／N值最大，阳性与阴性分界最明显；阴阳性临界点OD450值为0.32。根据已建立的ELISA方法及最佳反应条件，检测了890份血清样品，阳性率为92.8％。结果表明，本试验建立的间接-ELISA法具有特异性强、灵敏度高、操作简单、快速等特点，将为我国鸡传染性法氏囊病的免疫监测和血清流行病学调查提供有效的技术手段。