基于GEM展示技术内含肽介导的快速纯化系统的建立

• 作 者: 仝晴晴
• 机 构: 西藏大学
• 出 处: 西藏大学
• 发表日期: 2019年01期
• 关键词: 断裂型内含肽 GEM颗粒 C-末端剪切 蛋白纯化

蛋白纯化是疫苗制备过程中十分重要的一步,纯化标签可用于纯化多种目的蛋白。然而,标签移除仍然是必须解决的昂贵和重要的问题。所以如何通过廉价高效的方法对目的蛋白进行快速纯化是研究中急需解决的课题。内含肽自我剪切机制的发现为快速高效纯化目的蛋白奠定了基础。工程化Npu DnaE断裂型内含肽由112个氨基酸构成的N-片段和35氨基酸构成的C-片段组成,能够在没有N-末端剪切的情况下快速催化C-末端剪切。Npu DnaE突变体表现出硫代依赖性C末端快速的剪切,在断裂接合处将锚钩定位到内含肽N片段的N末端,从而避免了N片段和C片段之间相互作用的潜在空间位阻,使得快速剪切成为可能。GEM（Gram positive enhancer matrix）颗粒是乳酸菌经热酸处理后获得的细胞壁肽聚糖骨架,它不包含细菌原有蛋白质和核酸等大分子物质,与细菌细胞壁水解酶C端结构域（蛋白锚钩,PA）可以特异性非共价结合。因此,与PA连接的内含肽或者抗原,可以高密度地展示在GEM颗粒表面形成沉淀,仅需低速离心即可将目的蛋白纯化出来。基于GEM-PA展示系统与断裂型内含肽自我剪切的特性,我们开发了一种断裂型Npu DnaE内含肽介导的基于GEM展示平台的蛋白纯化方法。其中N和C外显子被蛋白锚钩（PA）和目的蛋白质（POI）取代,利用GEM颗粒与锚钩蛋白结合的特异性结合得到较为纯净的蛋白GEM-NC1A-PA,再利用断裂型内含肽的IC和IN结合获得融合蛋白GEM-NC1A-PA-C*-POI,最后利用内含肽的硫代剪切特性获得纯净的目的蛋白POI。在本研究中,工程化的Npu DnaE内含肽与GEM展示系统结合建立一种更加简洁高效的蛋白纯化方法,并以PCV2 Cap蛋白、犬α干扰素（Ca IFN-α）与鸡α干扰素（Ch IFN-α）为目的蛋白进行了一系列试验验证该纯化方法的可行性及适宜条件。构建了两个重组大肠杆菌,一个是断裂型内含肽C-片段和Cap的融合基因,表达C*-Cap,另一个是断裂型内含肽的N-片段和蛋白锚钩（PA）命名为PA-NC1A。PA-NC1A蛋白与GEM颗粒共价结合。然后将重组蛋白C*-Cap与GEM-PA-NC1A一起孵育,并根据断裂型内含肽的N-片段和C-片段之间的特异性结合离心获得GEM-PA-NC1A-C*-Cap。Cap蛋白可以通过在DTT存在下诱导断裂型内含肽的C末端剪切从GEM-PA-NC1A-C*-Cap纯化获得。利用Cap蛋白制备疫苗免疫ICR小鼠,结果表明该蛋白能够刺激小鼠产生针对Cap蛋白的免疫应答。分别构建含有断裂型内含肽C端与犬α干扰素融合基因（C*-Ca IFN-α）和含有断裂型内含肽C端与鸡α干扰素融合基因（C*-Ch IFN-α）的重组表达质粒并利用IPTG诱导表达。利用内含肽的N端与C端的结合,获得GEM-PA-NC1A-C*-Ca IFN-α和GEM-PA-NC1A-C*-Ch IFN-α。在DTT或EDTA存在情况下,内含肽C末端自我剪切,获得纯化的犬α干扰素和鸡α干扰素。通过MDCK/VSV方法测量Ca IFN-α蛋白的活性,结果表明,GEM/inteins纯化系统效果良好,纯化的犬α干扰素对VSV的活性达3.0×10~6U/m L。通过CEF/VSV方法测量Ch IFN-α蛋白的活性,结果表明,GEM/inteins纯化系统效果良好,纯化的鸡α干扰素对VSV的活性达1.2×10~8U/m L在本研究中,我们建立了Npu DnaE inteins介导的基于GEM展示技术的蛋白新型纯化系统。该系统利用GEM颗粒通过简单的离心操作获得PA-NC1A和PA-NC1A-C*-POI融合蛋白。它降低了纯化过程的额外成本,并且由于它们的高特异性,可以通过仅依赖于DTT或EDTA的剪切获得纯化的目的蛋白。因为操作简便,成本低且易于放大,因此可以用于疫苗生产的多种蛋白质的大规模纯化的候选方法,为快速有效纯化重组蛋白提供了一种全新的工具。