【摘 要】
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微量元素（如铜Cu）是生物生长和繁殖所必需的。然而微量元素在细胞中过量积聚也会有产生毒害作用,因此铜稳态的维持对于生物体生长发育和繁殖意义重大。目前,维持铜稳态的调控机制已在细菌、酵母和哺乳动物中进行了广泛研究,但在植物病原真菌中相关的研究报告较少。在本课题中,我们探究了小麦赤霉病的主要病原菌禾谷镰刀菌Fusarium graminearum中铜耐受的分子机制。研究发现,禾谷镰刀菌F.gramin
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微量元素（如铜Cu）是生物生长和繁殖所必需的。然而微量元素在细胞中过量积聚也会有产生毒害作用,因此铜稳态的维持对于生物体生长发育和繁殖意义重大。目前,维持铜稳态的调控机制已在细菌、酵母和哺乳动物中进行了广泛研究,但在植物病原真菌中相关的研究报告较少。在本课题中,我们探究了小麦赤霉病的主要病原菌禾谷镰刀菌Fusarium graminearum中铜耐受的分子机制。研究发现,禾谷镰刀菌F.graminearum中FgAceA基因编码维持铜稳态的转录调控因子,FgCrpA基因编码铜转运相关的P型ATPase蛋白（P-type ATPase）,FgCrdA基因编码金属硫蛋白（metallothioneins,MT）。转录组测序（RNA-Seq）结果显示在过量铜（100μM）处理野生型PH-1菌丝1 h可高水平诱导FgCrpA和FgCrdA的表达。实时荧光定量PCR也验证了这一结果,过量铜（100μM）处理FgCrpA基因在15 min表达水平达到峰值,FgCrdA基因在10 min表达水平达到峰值。通过靶向基因敲除技术敲除禾谷镰刀菌PH-1中FgAceA、FgCrpA和FgCrdA基因。生物学表型测定结果显示,与野生型菌株PH-1相比,FgCrpA基因缺失突变体ΔFgCrpA对铜胁迫变得敏感;与ΔFgCrpA相比,FgAceA基因缺失突变体ΔFgAceA对过量Cu2+更为敏感,而ΔFgCrdA对铜胁迫的敏感性与野生型菌株PH-1相比未发生显著变化。在过量Cu2+处理下,禾谷镰刀菌的分生孢子形状畸形,ΔFgAceA和ΔFgCrpA在产孢培养液CMC中分生孢子的产生明显减少甚至不产。此外,在过量Cu2+处理下,ΔFgAceA和ΔFgCrpA在寄主麦穗上的致病力显著减弱,次生代谢产物DON毒素（deoxynivalenol）产生量显著降低。双缺失突变体ΔFgAceAΔFgCrpA表现出比单缺失突变体更严重的表型缺陷。构建含有FgAceA或FgCrpA全长基因（含自身启动子区域）的互补载体,并将其转化到的对应的缺失突变体中,上述的表型缺陷得以恢复至野生型水平。ΔFgAceA在Fusarium Mininal Medium（FMM）培养基摇培过程中产大量的红色素aurofusarium。实时荧光定量PCR结果显示,FgAceA负调控aurofusarium生物合成基因的6个基因（PKS12、GIP1、GIP2、AURJ、AURF和AURO）的表达水平。此外,FgAceA调控FgCrpA的表达,ΔFgAceA中的FgCrpA基因受过量Cu2+诱导表达现象消失,FgCrpA表达水平显著下调。在ΔFgAceA中将FgCrpA基因加强启动子过表达后可恢复ΔFgAceA对铜的耐受性。综上所述,本研究结果表明禾谷镰刀菌中铜稳态的维持机制为通过借助P型ATP酶蛋白FgCrpA的铜泵出来维持铜稳态,FgAceA通过激活FgCrpA来调控铜离子的解毒作用。在过量Cu2+下,FgAceA和FgCrpA基因对禾谷镰刀菌的生长发育、毒素合成、致病性等方面都起着至关重要的作用,为寻找禾谷镰刀菌的防治方法提供了理论依据。
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