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结核病是严重危害全世界人类健康的一种慢性传染病。其致病菌为结核分枝杆菌,结核分枝杆菌具有强大的适应能力可以在宿主的免疫效应中生存,因此结核病是一种持续时间长的慢性传染病。在细菌的感染以及免疫逃避过程中其复杂的细胞壁结构发挥了举足轻重的作用。结核分枝杆菌作为引起结核病的病原菌,它不仅能够在肺部感染,同时可以入侵神经系统、免疫系统、骨骼、皮肤、关节以及大脑等重要的部位。所以研究结核分枝杆菌感染宿主细胞的生物学过程,结核分枝杆菌在宿主体内引起的免疫反应,以及巨噬细胞的吞噬作用有可能发现新的药物靶点,在对抗结核病过程中起到至关重要的作用。人们曾经认为O-甘露糖基化修饰是仅存在于真核生物的蛋白质修饰方式,近期的研究表明在放线菌中包括结核分枝杆菌中亦存在O-甘露糖基化蛋白。同时O-甘露糖基化蛋白对细菌入侵机体过程的影响以及与宿主免疫细胞相互作用等许多方面发挥着重要的作用。结核分枝杆菌细胞壁蛋白Rv1096是一种O-甘露糖基化蛋白具有脱乙酰基酶功能。在前期研究中,本课题组用糖基化在线预测工具预测到Rv1096蛋白的O-甘露糖基化位点是265Thr,并利用定点突变技术构建出265 Thr位点定点突变的Rv1096m2突变体。Smith等人的质谱结果显示结核分枝杆菌Rv1096蛋白的266Ser和267Ser也是O-甘露糖基化位点。因此,本课题以Rv1096m2基因为基础获得265 Thr 266Ser和267Ser O-甘露糖基化位点全突变的Rv1096am基因,并在耻垢分枝杆菌中表达Rv1096am突变体。同时,利用高表达Rv1096am的耻垢分枝杆菌和高表达野生型Rv1096耻垢分枝杆菌分别与RAW246.7巨噬细胞共培养,观察Rv1096蛋白O-甘露糖基化缺失对耻垢分枝杆菌在巨噬细胞中的存活率以及巨噬细胞分泌细胞因子的影响。一、结核分枝杆菌Rv1096去O-甘露糖基化蛋白突变体Rv1096am的表达与鉴定用定点突变方法获得265 Thr 266Ser和267Ser位点全突变的Rv1096am基因,构建pVV2-Rv1096am表达载体,在耻垢分枝杆菌中表达Rv1096am蛋白并进行纯化,用ConA凝集素鉴定Rv1096am蛋白是否发生去甘露糖基化。二、Rv1096蛋白O-甘露糖基化缺失对巨噬细胞的影响用高表达Rv1096am的耻垢分枝杆菌、高表达野生型Rv1096的耻垢分枝杆菌以及携带空载体的耻垢分枝杆菌分别与小鼠巨噬细胞RAW246.7孵育,观察细菌在巨噬细胞中的存活率以及培养基中细胞因子的差异。本文获得以下结果:一、Rv1096am突变体失去所有的O-甘露糖基化位点以Rv1096m2基因为模板获得O-甘露糖基化位点全突变的Rv1096am基因,构建出pVV2-Rv1096am表达载体。电转化pVV2-Rv1096am到耻垢分枝杆菌mc2155菌株中,获得耻垢分枝杆菌/Rv1096am表达菌株。用ConA凝集素对纯化的Rv1096am蛋白进行检测,发现其不能被ConA凝集素识别。说明Rv1096am蛋白的O-甘露糖基化位点已被全部突变。二、Rv1096蛋白O-甘露糖基化缺失影响巨噬细胞的荷菌量及细胞因子分泌Rv1096蛋白在缺失O-甘露糖基化修饰的情况下会降低耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活能力。因此,Rv1096蛋白的O-甘露糖基化修饰影响耻垢分枝杆菌在巨噬细胞的存活。当Rv1096蛋白缺失O-甘露糖基化修饰时,巨噬细胞培养基中的细胞因子IFN-γ、IL-6含量升高,而TNF-ɑ含量不变,Rv1096蛋白O-甘露糖基化修饰的缺失可促进细胞因子产生,加强机体的抗感染及促炎作用。结论:1.成功获得了O-甘露糖位点全突变的Rv1096am基因,构建出表达载体pVV2-Rv1096am及耻垢分枝杆菌/Rv1096am表达菌株。2.Rv1096蛋白在缺失O-甘露糖基化修饰的情况下降低耻垢分枝杆菌在巨噬细胞内的存活能力。通过检测细胞因子,推断Rv1096蛋白可能是结核分枝杆菌的毒力因子,Rv1096蛋白在缺失O-甘露糖基化修饰后会在一定程度上减弱结核分枝杆菌的毒力。未来研究方向:1.对Rv1096蛋白的糖链结构进行解析,并结合其糖链的连接方式研究糖链是否对结核分枝杆菌Rv1096影响。2.结核分枝杆菌Rv1096在感染过程中发挥的作用。研究在Rv1096蛋白O-甘露糖基化缺失的情况下对细菌与宿主的受体识别、介导细胞的信号通路以及对宿主细胞转录组的影响。