富马酸高效合成丝状真菌细胞工厂构建

• 作 者: 顾淑莹
• 出 处: 天津科技大学
• 发表日期: 2019年01期
• 关键词: 嗜热毁丝霉 代谢工程 富马酸 TCA还原途径 CRISPR/Cas9编辑技术

富马酸是一种重要的四碳化合物,并被认为是一种多功能的工业化学原料,广泛用于食品、化工和制药工业。目前生产富马酸主要是通过石化途径,以苯为初始原料,采用顺酐异构化工艺路线,这种工艺当中所使用的催化剂毒性较大,产生大量的温室气体CO2,对环境污染较重,且生产的富马酸纯度不高,不能满足市场对于食品医药级富马酸的要求。因此原料来源丰富、环境绿色友好,成本低廉的微生物发酵生产富马酸的研究引起受到人们的青睐。丝状真菌作为有机酸合成的传统菌株,具有诸多优势,收到了人们的关注。迄今为止,生物合成富马酸的相关研究主要集中在根霉属物种上,尤其是米根霉。由于丝状真菌遗传背景较为复杂,缺乏成熟的操作系统,相关富马酸代谢途径的理性改造发展缓慢,主要通过诱变育种以及发酵条件优化提高工业菌株富马酸合成能力。但仍然面临产物转化率低,发酵性状差等问题,难以满足工业生产的需要,亟需开发新的富马酸合成体系。嗜热毁丝霉是高温木质纤维素降解菌,能够快速的降解各种生物质,并能快速利用其水解物进行代谢,通过代谢途径改造有望将嗜热毁丝霉改造为能利用木质纤维素一步发酵生产生物基化学品的工业菌株,显著降低有机酸发酵成本。目前实验室已经发展了成熟的分子遗传操作手段。基于此,本课题通过代谢工程手段,利用CRISPR/Cas9编辑技术,结合合成生物学理念,首次探索嗜热毁丝霉生产富马酸的潜力,主要包括了富马酸转运模块导入,还原性TCA途径的改善,富马酸代谢支路途径的敲除,以及胞内增加前体苹果酸的含量。具体为:1)通过导入有机酸转运蛋白Spmae,初步实现了丝状真菌富马酸的构建;2)筛选不同来源的富马酸酶,实验数据表明当在嗜热毁丝霉中过表达来自克鲁斯式念珠菌的富马酸酶时,富马酸产量量最高,与亲本菌株相比,富马酸的产量增加了 3倍。3)为了进一步提高富马酸的产量,我们敲除了细胞内富马酸其他代谢支路途径。在缺失嗜热毁丝霉的两种富马酸还原酶和线粒体富马酸酶基因后,所得到的菌株富马酸产量比亲本菌株增加2.33倍。4)接着又提高了细胞内苹果酸浓度促进嗜热毁丝霉富马酸合成,所得到的菌株富马酸的产量与亲本菌株相比增加42%。最后,与对照菌株相比,敲除苹果酸-天冬氨酸穿梭蛋白后使细胞内苹果酸含量增加2.16倍,富马酸产量增加42%。在发酵罐中以葡萄糖为碳源,富马酸产量达到17 g/L。本研究探索了嗜热毁丝霉富马酸合成途径,并成功构建了嗜热真菌富马酸细胞工厂,为实现以廉价原料生物质合成富马酸提供有利条件,对生物基化学品合成这一重大战略性新兴产业具有一定的促进作用。