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谷氧还蛋白(Glutaredoxin,Grx)是生物体内普遍存在的巯基-二硫键氧化还原酶。根据活性位点氨基酸残基序列的保守性,谷氧还蛋白可以分为双巯基谷氧还蛋白(dithiol Grx)、单巯基谷氧还蛋白(monothiol Grx)和CC型谷氧还蛋白(只存在于高等植物中)。作为谷氧还蛋白家族的一个重要分支,人们对monothiol Grx的研究远远不如dithiol Grx充分。杨树谷氧还蛋白S14(GrxS14)属于CGFS类型的monothiol Grx,它具有两种结构形式:一种是单体(apo态),具有常规的谷氧还蛋白性质;另一种是holo态,它以两个GrxS14分子和两个谷胱甘肽分子以及一个桥接的[2Fe-2S]形成铁硫蛋白。Holo GrxS14可以高效地将铁硫簇转移给铁氧还蛋白(ferredoxin,Fdx),发挥铁硫簇构架蛋白的功能。本论文的研究工作主要包括GrxS14的三维空间结构解析以及在铁硫簇转移过程中的作用机制。 首先,在谷胱甘肽的存在条件下解析了还原态apo GrxS14的溶液结构。ApoGrxS14结构中在β1与α2之间含有一段十个氨基酸残基组成的较长的loop区域,这一结构特征在monothiol Grx中具有保守性。而dithiol Grx结构中通常含有一段较短的loop区域,约四个氨基酸残基。根据谷胱甘肽滴定apo GrxS14的结果,然后建立了apo GrxS14结合GSH的结构模型,确定了apo GrxS14结构中的谷胱甘肽结合位点。它对于了解GrxS14对谷胱甘肽化底物的识别和催化具有重要意义。并且apo GrxS14对谷胱甘肽的结合可能有利于holo GrxS14的形成。 Apo GrxS14在溶液中表现出一定的聚合能力,具有单体-二聚体的平衡,而谷胱甘肽能够抑制apo GrxS14的聚合。根据不同浓度下apo GrxS14的2D1H-15NHSQC谱图差异,然后建立了apo GrxS14二聚体的结构模型。结构模型显示,apo GrxS14二聚界面间的相互作用主要包括:两分子的活性位点区域F35残基之间的芳环堆积作用;一个分子中的D88,E92和K95残基与另一分子中的R62和K66残基之间的盐桥相互作用。比较apo GrxS14结构中二聚界面与谷胱甘肽结合位点,发现谷胱甘肽的结合位点包含在二聚界面之内,这就说明apo GrxS14的二聚化与谷胱甘肽的结合是不兼容的,因而从结构上解释了谷胱甘肽谷胱对聚合的抑制作用。 利用NMR和CD光谱,研究首次发现,除了holo GrxS14之外,dithiol类型的holo态谷氧还蛋白如人类Grx2(holo hGrx2)和杨树GrxCl(holo pGrxC1)也能够作为铁硫簇构架蛋白,将铁硫簇转移给apo Fdx。NMR数据显示,三个holo态谷氧还蛋白与apo Fdx之间的铁硫簇转移通过它们之间的直接相互作用进行。并且apo Fdx与这三个holo态谷氧还蛋白之间具有不同的相互作用类型,而这种差别可能与铁硫簇的转移效率相关。利用CD光谱研究发现,对于蓝藻apo Fdx作为接受蛋白,holo pGrxS14表现出比holo hGrx2和holo pGrxC1高得多的铁硫簇转移效率。由于holo pGrxS14和hGrx2均具有不稳定的铁硫簇,而holo pGrxC1的铁硫簇较为稳定,因而铁硫簇转移效率的差异与holo态谷氧还蛋白中铁硫簇的稳定性并没有直接的关系。 另一方面,研究发现,自由的谷胱甘肽能够抑制holo态谷氧还蛋白的铁硫簇转移过程。作为铁硫簇配体的谷胱甘肽能够与自由的谷胱甘肽进行交换,而这一过程与铁硫簇的稳定性无关。Holo态谷氧还蛋白中谷胱甘肽的可交换性可能是因为谷胱甘肽与铁硫簇之间的配位键相对的较弱,它易于被其它的含有半胱氨酸的分子取代。因而,根据结果推测,在holo态谷氧还蛋白的铁硫簇转移过程中,apo Fdx很有可能优先取代与铁硫簇配位的谷胱甘肽分子,进而接受完整的铁硫簇,形成holo Fdx。在这个过程中,自由的谷胱甘肽与apo Fdx之间具有直接的竞争关系,它们共同竞争铁硫簇的谷胱甘肽配位位点,因而谷胱甘肽的浓度能够调控铁硫簇转移的速度。考虑到谷胱甘肽在生物体内各个细胞器中的浓度变化,这一调控机制说明谷胱甘肽除了作为holo态谷氧还蛋白中铁硫簇的配体之外,它还可能通过holo态谷氧还蛋白进行调控铁硫簇在生物体内的合成与运输,具有更加重要的生理功能。这一功能也使holo态谷氧还蛋白具有铁硫簇的暂时存储,或者是作为铁硫簇的“仓库”的可能,在不同的细胞环境以及对环境的应激反应下进行铁硫簇的“存储”和“发送”。