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第一部分rhGH对有/无LPS刺激的PMNs凋亡和CD11b表达的影响
目的:观察rhGH对有/无LPS刺激两种状态下离体培养的PMNs凋亡和CD11b表达的影响
方法:采集健康人外周静脉血,采用血浆-percoll不连续密度梯度离心法分离中性粒细胞,以10%热灭活胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的RPMI-1640培养液悬浮细胞。PMNs悬液分为四个试验组:对照组(n=10)、rhGH(100ng/ml)组(n=10)、LPS100ng/ml组(n=10)和LPS100ng/ml刺激1h后加rhGH100ng/ml组(n=10),在37℃、5%CO2的孵育箱中离体培养3h和24h后采用光镜、电镜、DNAladder和流式细胞仪评估PMNs的凋亡率以及流式细胞仪检测PMNsCD11b的表达。
结果:无LPS刺激状态下,rhGH可引起PMNs早期凋亡率减少、存活率增加,但不影响晚期凋亡/死亡率;有LPS刺激状态下,rhGH不影响PMNs早期凋亡率、晚期凋亡/死亡率和存活率,而且可能能下调LPS对PMNs的抑制作用。与对照组比较,rhGH不影响离体培养3h和24h的PMNs表达CD11b的MFI,而LPS组和LPS+rhGH组则增加其表达CD11b的MFI值(P<0.01);与LPS组比较,LPS+rhGH组PMNs表达CD11b的MFI值不增加(P>0.05);与rhGH组比较,LPS组和LPS+rhGH组PMNs表达CD11b的MFI值增加。此外,相关分析发现,PMNs凋亡和CD11b表达之间不存在线性相关关系。
结论:无LPS刺激状态下,rhGH可延迟PMNs凋亡、增强PMNs活力;与LPS共同孵育时,rhGH不影响PMNs凋亡和活力,但能轻度下调LPS对PMNs凋亡的抑制作用。rhGH对静息和LPS活化的两种状态的PMNs表面的粘附分子CD11b的表达都没有影响。
第二部分 不同剂量的rhGH对PMNs粘附和呼吸爆发的影响
目的:观察不同剂量rhGH对有/无LPS刺激的离体培养PMNs粘附和呼吸爆发功能的影响。
方法:采集健康人外周静脉血,采用血浆-Percoll不连续密度梯度离心法分离出高纯度和高活力的PMNs,以10%热灭活胎牛血清、青霉素100U/ml、链霉素100U/ml的RPMI-1640培养液悬浮细胞。PMNs悬液分为四个试验组:对照组(n=8)、10ng/ml的rhGH组(n=8)、100ng/ml的rhGH组(n=8)和1000ng/ml的rhGH组(n=8)。无菌取新生儿脐带,0.1%胶原酶消化细胞,用10%胎牛血清1640培养液常规培养,4~7天融合成单层;以0.125%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化,洗涤后以10%胎牛血清1640培养液悬浮,以1×105/ml种入6孔板,生长至融合状态。将长成单层的HUVEC的培养基去掉,从各组培养的PMNs悬液中取0.5ml加到HUVEC之上,放入培养箱中孵育30min,然后倒掉上清,冲洗两次。采用脱落细胞计数法计算出各试验组的PMNs和HUVEC的粘附率。采用NADPH氧化酶活性法检测各试验组PMNs的呼吸爆发功能。
结果:与对照组比较,10ng/mlrhGH组PMNs和EC的粘附率增加,但没有统计学意义(P=0.093);100ng/mlrhGH和1000ng/mlrhGH组的PMN与EC的粘附率增加有显著的统计学意义(P值分别为0.029和0.039)。与对照组比较,rhGH三个浓度组的NADPH酶活性均有升高,10ng/mlrhGH组升高不明显,没有统计学意义(P为0.185),100ng/ml和1000ng/ml浓度组显著升高,有统计学意义(P值分别为0.01和0.03);有意思的是,100ng/ml的rhGH比1000ng/ml的rhGH升高NADHP的活性更为显著。
结论:rhGH增强PMNs与EC的粘附和呼吸爆发功能呈现剂量依赖性,10ng/ml的rhGH稍增强PMNs与内皮细胞的粘附和呼吸爆发功能,但没有统计学差别;100ng/ml的rhGH和1000ng/ml的rhGH能显著增强PMNs与内皮细胞的粘附和呼吸爆发功能。