论文部分内容阅读
睾丸是雄性个体最重要的生殖器官,它不仅是精子生成的重要场所,而且还具有分泌雄性激素、维持副性特征的功能。睾丸中主要有三种细胞--赖氏细胞、支持细胞、生殖细胞。赖氏细胞位于曲细精管之间,其分泌的睾酮等雄性激素维持着睾丸内外的激素环境；支持细胞位于睾丸曲细精管内基底膜附近,它们之间的紧密连接形成血睾屏障,将分化至各阶段的生殖细胞包裹在其中,为精子发生提供免疫豁免环境。研究证实在睾丸中血睾屏障为精子的发育提供了一种免疫屏障,它不仅可是一个有选择性通透作用的屏障,能维持上皮细胞层两侧物质成分的差异的屏障而且,它被多种方式调控,选择性地允许物质通过；它还可能参与细胞间的信号传递实现动态变化,然而,在精子发生过程中,究竟血睾屏障如何进行动态变化的分子结构和相关功能变化机制尚不清楚。
近年来方面血睾屏障的研究主要集中于血睾屏障组成部分紧密连接和黏附连接。尽管紧密连接和黏附连接的分子结构已经得到了初步的研究,鉴定出了一些重要的结构膜蛋白,但其在血睾屏障中动态变化中的作用和机制仍不甚明了,备受争论。由此,我们提出问题：在血睾屏障动态变化中,其分子结构是否发生变化,如果答案是肯定的说明血睾屏障结构膜蛋白分子在起着关键的作用,相反,说明血睾屏障分子结构不发生改变。
鉴于以上认识,本实验从紧密连接和黏附连接入手,分别建立镉处理和白消胺模型,模拟睾丸内血睾屏障“打开”和“关闭”的过程,镉处理模型模拟紧密连接动态变化过程,白消胺模型模拟黏附连接变化过程,并对血睾屏障核酸和蛋白水平进行观察分析,观察血睾屏障动态变化过程中其分子结构和功能是否发生变化。
结果显示,镉处理后在7小时到48小时内,小鼠黏附连接结构膜蛋白表达量呈下降趋势,紧密连接结构膜蛋白表达量也随之降低,切片观察显示血睾屏障被打开,发生动态变化。白消胺模型结果显示处理14天到90天时,黏附连接结构膜蛋白表达量呈下降趋势,紧密连接结构膜蛋白表达量也随之降低,从90天到150天时紧密连接结构膜蛋白表达量和黏附连接结构膜蛋白表达量逐渐回升.这些说明本实验所使用的实时荧光定量PCR技术和免疫印迹技术是成熟的。由于紧密连接和黏附连接都参与了血睾屏障动态变化,而精子发生却要首先从基底膜开始穿越支持细胞之间和与生精细胞间形成的紧密连接与黏附连接再到达管腔,证明在紧密连接和黏附连接结构膜蛋白的动态变化下,精母细胞可以穿越小鼠睾丸的紧密连接和黏附连接,使得细线期精母细胞完全穿越血睾屏障；亦证明了荧光定量PCR技术和血睾屏障示踪等检测血睾屏障结构和功能技术的稳定和可靠性为本研究提供了技术保障。
实验步骤分两种情况,一是通过生物素示踪技术观察所建立的动物模型的血睾屏障是否发生变化并通过示踪物侵入距离来分析其变化程度,二是针对不同处理模型和不同时间点RNA的样本进行实时动态分析,并对其蛋白表达量进行统计。血睾屏障生物素示踪结果显示,棕色的生物素沉淀进入到动物模型的曲细精管腔内部,随着处理时间的增加其示踪物侵入距离和程度越明显,通过数据统计说明镉和白消胺处理模型的血睾屏障已经发生动态变化,即可以模拟正常情况下血睾屏障通透性变化的过程；对不同处理模型和不同时间点RNA的样本进行实时动态分析结果显示,紧密连接和黏附连接的结构膜蛋白会随着血睾屏障的动态变化而升高和降低,二者存在着信号传递上的联系,并且随着药物针对靶位的不同紧密连接和黏附连接发生变化的顺序和蛋白表达量也有差别,这说明在血睾屏障动态变化过程中存在着一套复杂的分子变化机制。
由上可知,当针对研究紧密连接变化的镉处理模型中,黏附连接膜蛋白先于紧密连接膜蛋白发生变化,表达时间和量上二者均有较大差别；在针对研究黏附连接的白消胺模型中,黏附连接蛋白膜先于紧密连接膜蛋白发生变化,并先于紧密连接膜蛋白在150天后恢复。
本课题采用血睾屏障生物素示踪和实时荧光定量PCR研究血睾屏障膜蛋白的相互关系及动态变化过程,结果验证了血睾屏障动力学研究上的紧密连接“打开“”关闭“假说和黏附连接“聚合”“解聚”假说,发现了血睾屏障动态变化中存在着一套复杂的分子变化机制,说明在动态变化过程中其结构膜蛋白具有关键的作用,是血睾屏障动态变化中的重要建筑模块。本研究不仅为最终阐明血睾屏障动态变化提供可靠的依据；而且对建立新型血睾屏障动态变化研究模型具有重要的理论意义,同时为哺乳动物睾丸内微环境研究打下基础,也为推动雄性生殖生物学临床应用起到积极的作用,可为男性不育患者带来福音。