【摘 要】
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中性蛋白酶是一类作用条件相对温和的蛋白酶类，具有重要的应用价值。但一般的中性蛋白酶热稳定性较差，所以在应用中易于失活，而由耐热菌株所产生的高温中性蛋白酶具有相对较好的
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中性蛋白酶是一类作用条件相对温和的蛋白酶类，具有重要的应用价值。但一般的中性蛋白酶热稳定性较差，所以在应用中易于失活，而由耐热菌株所产生的高温中性蛋白酶具有相对较好的热稳定性。现有的研究表明，大部分的高温中性蛋白酶都隶属于金属蛋白酶类。
本文以耐热地衣芽孢杆菌(.Bacillus licheniformis)XJT9503为出发菌株，通过特异性引物设计与PCR方法获得高温中性蛋白酶基因dmp，通过测序与分析发现dmp与枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)所编码的孢外金属蛋白酶基因(mpr)同源性高达98％，氨基酸序列同源性达99％。用Pst I、Hind Ⅲ对dmp进行酶切处理，获得tnp基因片段，构建外泌型原核表达载体pPL-tnp并导入孢外蛋白酶缺失枯草芽孢杆菌AB97013中，获得孢外蛋白酶表达产物，通过最适酶解温度与pH特性的测定证明所获得的dmp基因为高温性蛋白酶基因，其主要酶学特性与原始菌株XJT9503所产生的孢外蛋白酶相同，证明PCR获得的dmp基因为目标基因。
通过对dmp基因的改造，使之适合于毕赤酵母表达的需要，并在dmp基因ORF两端添加.EcoR I、NotI酶切位点。通过EcoR I、Not I双酶切获得高温中性酶基因片段并连接于pPIC9K的EcoR I、Not I位点。正向连接的pPIC9K-tnp质粒经Sac I线性化后电转化巴斯德毕赤酵母GS115。发酵培养与产物特性验证，证明重组菌PIC-5表达了具有活性的高温中性蛋白酶。
重组菌PIC-5表达的高温中性蛋白酶特性测定表明，基因工程表达的蛋白酶与原始菌XJT9503特性基本相同，但其在热稳定性较原始菌株所表达的胞外蛋白酶有显著的提高，说明原始菌株产生的胞外蛋白酶可能是复合酶系。
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