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研究目的:1检测多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)U266细胞高迁移率组蛋白B1(high mobility group boxl,HMGB1)mRNA、HMGB1 及其表面受体的表达;2检测外源性HMGB1对MM细胞增殖影响;3检测外源性HMGB1是否能活化核因子-κB(Nuclear factor κB,NF-κB)通路;4.检测外源性HMGB1是否能通过活化NF-κB通路刺激MM细胞的增殖;5采用HMGB1抑制剂正丁酸钠抑制U266细胞HMGB1的表达,明确内源性HMGB1在MM细胞增殖和凋亡中的作用。研究方法:1.体外培养MMU266细胞株,采用Western Blot法检测HMGB1蛋白及细胞表面HMGB1主要受体即晚期糖基化终产物受体(Receptor of Advanced Glycation End products,RAGE)和Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)的表达,RT-PCR检测HMGBlmRNA的表达。2.用不同浓度的外源性HMGB1(0,50,100,150,200,250,500ng/ml)预处理U266细胞株24h及48h后,采用CKK8法检测不用浓度的外源性HMGB1对MM细胞增殖的影响。3.体外培养MMU266细胞株,用重组HMGB1分别刺激MM细胞0、5、10、30和60min,收集总蛋白,western blot检测胞核蛋白NF-κB。4.体外培养MMU266细胞株,使用不同浓度PDTC(—种NF-κB抑制剂)(0,50,100,200uM)预孵育的方法抑制NF-κB信号通路的活化,再以HMGB1刺激细胞,24h后CCK8法检测U266细胞数,评估PDTC抑制NF-κB信号通路活化后HMGB1是否仍能促进MM细胞的增殖。5.体外培养MM U266细胞株,加入不同浓度的HMGB1抑制剂正丁酸钠(OmM,0,625mM,1.25mM,2.5mM,5mM,10mM,20mM,40mM)分别培养24h及48h后。采用Western Blot法检测U266细胞株中HMGB1的表达,筛选出正丁酸钠最佳抑制时间与浓度(48h,1.25mM)。将U266细胞株分为对照组及实验组,对照组正常培养,实验组加入正丁酸钠(1.25mM,48h)抑制HMGB1表达后,采用CCK8法及流式细胞术检测对照组及实验组,评估HMGB1的表达与MM细胞增殖及凋亡的关系。研究结果:1.在U266细胞株中,Westren Blot检测到HMGB1蛋白、HMGB1主要受体即RAGE和Toll样受体的表达,RT-PCR检测到HMGB1mRNA表达。2.外源性HMGB1刺激U266细胞24h,与对照组比,50,100,150,200,250,500ng/ml HMGB1处理组的OD值均增高[(0.365±0.000)vs(0.319±0.006);(0.362±0.007)vs(0.319±0.006);(0.360±0.002)vs(0.319±0.006);(0.361±0.003)vs(0.319±0.006);(0.351±0.003)vs(0.319±0.006);(0.366±0.005)(0.319±0.006)],差异具有统计学意义(P<0.05)。外源性HMGB1刺激U266细胞48h后,与对照组比,50,100,150,200,250,500ng/ml HMGB1 处理组的OD值均增高[(0.523±0.007)vs(0.509±0.009);(0.522±0.002)vs(0.509±0.009);(0.534±0.004)vs(0.509±0.009);(0.538±0.004)vs(0.509±0.009);(0.534±0.010)vs(0.509±0.009);(0.601±0.009)vs(0.509±0.009)],差异具有统计学意义(P<0.05)。3.Western blot显示HMGB1刺激MM细胞后,核蛋白NF-κB表达量有上升趋势,与对照组(加入外源性HMGB1 Omin)相比,实验组(加入外源性HMGB160min)核蛋白NF-κB/甘油醛-3-磷酸脱氢酶((glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)明显增加[(0.83±0.02)vs(0.41士0.05)](P<0.01)。4.CCK8法显示:与对照组(PDTC:OuM)比较,实验组细胞(PDTC:50uM、100uM、200uM)OD值明显下降[(1.59±0.17)vs(0.05±0.00);(1.59±0.17)vs(0.05±0.01);(1.59±0.17)vs(0.05±0.01)],差异具有统计学意义(P<0.05),表明HMGB1可通过活化NF-KB通路促进MM细胞增殖。5.Western Blot法显示HMGB1抑制剂正丁酸钠的最佳抑制浓度及时间为1.25mM及48h。CCK8法发现与对照组细胞株比较,实验组细胞的生长显著下降(48h,P<0.01)[(0.35±0.00)vs(0.49±0.01)],细胞凋亡率显著增加(P<0.01)[(3.75±0.11)%vs(2.55±0.27)%],差异均有统计学意义。实验结论1.HMGB1在多发性骨髓瘤U266细胞株中存在mRNA和蛋白水平的表达,同时其主要受体RAGE和Toll样受体也存在表达。2.外源性HMGB1刺激后,U266细胞呈现增殖现象。3.外源性HMGB1刺激MMU266细胞后,核蛋白NF-κB表达量增加,与对照组(加入外源性HMGB1 Omin)相比,实验组(加入外源性HMGB1 60min)核蛋白NF-Kb/GADPH明显增加(P<0.01)。说明HMGB1可活化NF-κB通路。4.PTDC阻断NF-κB通路后,外源性HMGB1促进MM细胞增殖的作用也被阻断。说明HMGB1可通过活化NF-κB通路刺激多发性骨髓瘤U266细胞增殖。5.与对照组相比,正丁酸钠抑制U266细胞株内源性HMGB1表达后,U266细胞的增殖下降,凋亡率显著增加。说明干扰多发性骨髓瘤U266内源性HMGB1的表达后可抑制细胞增殖,促进细胞凋亡。