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随着基因工程、蛋白质工程、细胞工程以及免疫学技术的发展，肝癌相关抗原的研究取得了飞速进展，多种新的肝癌抗原被发现和报道，然而肝癌的发生、发展涉及到肝癌细胞多分子的调变，目前并没有一种完整的方法能精确探测到所有肝癌相关抗原，若利用多种技术的组合寻找，筛选并鉴定新的抗原分子，对于肝癌的诊疗研究将具有重要的价值，其中噬菌体抗体库(phage antibody library)技术是应用最为广泛的筛选体系。本课题拟应用迄今为止报道库容量最大的人源噬菌体抗体库(Griffin.1 Library)，通过活细胞筛选获得能与肝癌细胞系HepG2特异结合的单链抗体，为肝癌早期诊疗的实验研究奠定基础。 目的： 从人源噬菌体抗体库(Griffin.1 Library)中筛选与肝癌细胞系HepG2特异性结合的单链抗体，通过原核细胞表达并对其生物学特性进行研究，为寻找肝癌细胞表面特异性标志及其靶向诊断与治疗研究奠定基础。 方法： 1、单链抗体的筛选与序列分析 以正常肝细胞系L02为阴性筛选细胞，以肝癌细胞系HepG2为阳性筛选靶细胞，从人源噬菌体抗体库(Griffin.1 Library)中筛选与肝癌细胞系HepG2特异性结合的噬菌体，经三轮差异筛选后，挑取仅与肝癌细胞系HepG2结合的阳性菌，采用与载体序列互补的一对通用引物LMB3和pHENSeq，通过质粒PCR筛选其中含有单链抗体基因的克隆;进一步以L02和HepG2为靶细胞，通过细胞ELISA及流式细胞术(FCM)筛选仅与HepG2特异性结合的单链抗体噬菌体;阳性噬粒通过ABI3730全自动荧光测序仪测序，通过IMGT软件和GeneBank将测序结果进行比对与同源性分析; 2、单链抗体的表达、纯化与鉴定 将仅与肝癌细胞系HepG2特异性结合的阳性克隆噬菌体感染表达宿主菌HB2151，经IPTG诱导单链抗体的表达，采用12％SDS-PAGE电泳对表达产物在菌体中的定位，表达产物经IMAC柱纯化后，经12％SDS-PAGE电泳、Western-blot及ELISA方法分析检测纯化抗体的特性。 3、单链抗体的特异性测定 采用FCM及ELISA鉴定纯化抗体与肝癌细胞株HepG2以及不同肿瘤细胞株结合特性，并以正常肝细胞株为对照;采用细胞计数法检测所纯化的单链抗体对肝癌细胞株HepG2生长的作用;以制备纯化的单链抗体作为一抗，采用免疫组化技术检测SLH10与不同组织，包括原发性肝癌、肝癌旁、胃癌、食管癌、乳腺癌、宫颈鳞状细胞癌、卵巢浆液性乳头状囊腺瘤、肺鳞状上皮细胞癌结合的特性。 结果： 1、单链抗体的筛选与序列分析结果 以正常肝细胞系L02和肝癌细胞系HepG2为筛选靶细胞，经三轮差异筛选后，获得31个阳性单个克隆，通过质粒PCR证实12个克隆含有单链抗体大小的片断，细胞ELISA及FCM证实获得3株与肝癌细胞系HepG2相对特异性结合的单链抗体噬菌体;经DNA测序，基因序列分析，确定2个阳性克隆，分别插入不同序列的单链抗体片段;经分析后确认为人免疫球蛋白的VH和VL序列，并以Linker:-(G4S)2-GGS-连接。两个克隆均具有完整开放阅读框，其载体中信号肽序列、插入序列相应酶切位点及Linker序列与载体图谱完全吻合。scFv-04重链属IGHV2家族，轻链为Vκ2家族，scFv-10重链属IGHV1家族，轻链为Vλ3家族。另一克隆25号的VH CDR3区缺失，其与细胞结合的阳性率亦显著低于上述二株单克隆。将筛选获得的2个与肝癌细胞系HepG2结合相对特异性的单链抗体，分别命名为SLH04及SLH10，并将序列登陆Genebank，序列号为AY686498-AY686499。 2、单链抗体的表达定位与纯化 SLH04及SLH10于30℃经IPTG诱导20h，结果提示细菌外周质中存在目的蛋白表达，上清中亦有微量表达，分子量大小为31KDa左右，与理论计算值相符。取细菌外周质经Ni-NTA层析柱过柱纯化并通过12％SDS-PAGE鉴定，提示咪唑浓度为40mM及60mM时目的蛋白得到有效洗脱。SLH10结果与此同。5μg纯化的单链抗体SLH04及SLH10经12％SDS-PAGE电泳并转移到硝酸纤维素膜上，DAB显色后于31Kd处可见条带。 3、单链抗体与癌细胞以及组织结合的特性 将纯化抗体分别与两种细胞几种细胞系进行ELISA和FCM检测，结果表明纯化的单链抗体与HepG2的结合为强阳性，与L02细胞结合与空白对照比较，未显示出结合的差异性，与其他细胞系结合亦为阴性，表明纯化抗体能与HepG2细胞株特异性结合。经显微镜观察和细胞计数结果表明，经无关抗体处理组及未处理HepG2细胞组比较，细胞生长曲线无差异，经SLH04和SLH10处理对HepG2细胞生长有抑制作用。以纯化的SLH10作为一抗，免疫组化结果显示肝癌组织染色为棕色，而其它癌组织及肝癌旁组织为阴性，提示纯化抗体与肝癌组织具有相对特异性结合的特性。 结论： 以正常肝细胞系L02和肝癌细胞系HepG2为筛选靶细胞，通过差异筛选，从人源噬菌体抗体库中筛选获得与肝癌细胞系HepG2特异性结合的单链抗体，并成功表达，纯化的单链抗体与肝癌细胞及肝癌组织的结合，与正常肝细胞以及肝癌旁组织比较，具有明显差异。结果表明所获得的单链抗体具有功能活性与特异性，为寻找肝癌细胞系HepG2表面特异性抗原及靶向研究奠定了基础。