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前列腺癌是欧美国家男性最常见的恶性肿瘤。在美国,其发病率在肿瘤患者中占第1位,死亡率仅次于肺癌。我国目前尚无前列腺癌发病率和死亡率的精确统计资料,但随着人民生活水平的提高和人群普查的开展,发病率逐年增高。大约有30 %～50 %前列腺癌患者在初诊时已经有转移发生。早期的局限性前列腺癌可通过手术根治或放疗治愈,但是仍有超过1/3初诊为局限性前列腺癌并接受正规治疗的患者进一步恶化,出现全身转移。对于根治术后复发的或已有转移的晚期前列腺癌,可以通过施行内分泌治疗获得短期疗效,但最终肿瘤会表现为激素非依赖性,对于发展到这一时期的患者,至今没有一种疗效确切的治疗方法。免疫治疗是现代肿瘤综合治疗中的一种重要手段。随着肿瘤免疫理论的突破和分子生物学技术的发展,提出了肿瘤疫苗的概念,其基本的策略是通过诱导或激活肿瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)而诱发有效的抗肿瘤免疫反应。这一策略的主要局限在于高度特异性的肿瘤抗原的缺乏以及对有效递呈肿瘤抗原途径认识的不足。应用抗原递呈细胞(antigen-presenting cell, APC)来直接促进抗原递呈是递呈肿瘤抗原的高效途径。近来,以树突状细胞(dendritic cell,DC)为基础的肿瘤疫苗治疗逐渐成为肿瘤治疗研究的热点。DC是功能最强的APC,也是目前发现的唯一能激活静息T细胞增殖,并能够调控天然免疫反应和获得性免疫反应的抗原递呈细胞。它能够识别、加工并递呈肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen, TAA),激活CTL,有效的启动机体特异性的抗肿瘤细胞免疫反应。肿瘤患者存在肿瘤浸润性DC数量减少和功能缺陷的特点。与正常的DC 相比,肿瘤浸润性DC缺乏刺激T 细胞增殖及产生细胞因子的能力,其递呈抗原的功能发生缺陷,这正是肿瘤<WP=7>免疫逃逸的机制之一。研究人员观察前列腺癌组织标本发现,肿瘤组织中巨噬细胞数量最多,T细胞次之,而DC仅占白细胞总数的10 %以下,而且DC及朗罕氏细胞的数量明显少于正常前列腺组织。最近研究发现前列腺肿瘤细胞不仅可以诱导成熟DC凋亡,而且抑制未成熟DC的分化成熟,从而减少DC数目并抑制其功能。DC的缺乏和功能不良是前列腺癌免疫逃逸以及其他免疫治疗不能取得良好效果的一个重要原因。通过纠正前列腺癌患者DC功能缺陷以诱发或增强机体对前列腺癌的免疫应答成为晚期前列腺癌免疫治疗新的切入点。以DC为基础的肿瘤疫苗疗法是指在体外分离出患者DC后,将肿瘤抗原通过不同的方式转入DC,然后DC通过摄取、加工并将肿瘤抗原以主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC)肿瘤抗原复合物的形式表达于DC表面,制成肿瘤疫苗,启动针对肿瘤的特异性免疫反应来杀伤肿瘤细胞。而使用何种抗原及如何将肿瘤抗原在体外与DC结合以纠正其功能缺陷,则成了应用DC疫苗进行免疫治疗的关键。前列腺干细胞抗原(prostate stem cell antigen,PSCA)是一个新近发现的肿瘤相关性细胞表面抗原,具有前列腺癌特异性。研究表明,PSCA在正常前列腺组织和前列腺增生组织中呈低表达,在约80%的前列腺癌中呈高表达,激素依赖和非激素依赖型前列腺癌之间无明显差异,在前列腺癌的骨转移灶中全部呈高表达且表达水平较原发灶明显升高。因此认为PSCA可能成为肿瘤免疫治疗的一个理想靶向抗原。诱导针对PSCA的特异性细胞免疫的治疗方法,必将为前列腺癌的治疗,尤其是晚期激素非依赖性前列腺癌的治疗带来新的契机。本研究应用自行构建的重组PSCA原核表达载体pET32a,表达、纯化制备了高纯度PSCA-TRX融合蛋白,并利用此融合蛋白冲击致敏由外周血单个核细胞分离培养得到的人DC,构建成负载PSCA的DC疫苗。对其活化前后的表型变化进行了鉴定,并检测了其在体外刺激T细胞增殖的能力。利用负载PSCA的DC诱导自体外周血T淋巴细胞分化为抗原特异性CTL,通过淋巴细胞毒性试验检测所得CTL对负载PSCA的DC靶细胞以及表达PSCA的前列腺癌细胞PC-3的体外杀伤活性。构建人前列腺癌PC-3细胞在Balb/c裸鼠体内的皮下荷瘤模型,观察PSCA特异性CTL在裸鼠体内对PC-3肿瘤细胞的直接杀伤效应<WP=8>和治疗肿瘤的效果。首先,利用pET32a原核表达系统制备了PSCA融合蛋白。从培养的人前列腺癌细胞株PC-3中提取总RNA进行RT-PCR及特异扩增,获得人PSCA基因的一段编码区序列(241bp,编码21-99位氨基酸),经序列分析证实,与Genbank 报道的人PSCA基因中相应区域完全一致。以EcoR I、Xho I 双酶切,回收目的片段后定向插入经同样双酶切的pET32a载体中,将重组质粒转化感受态大肠杆菌BL21(DE3),常规筛选阳性克隆、测序、酶切鉴定无误后,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达PSCA-TRX融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白。灰度扫描显示IPTG诱导3h后融合蛋白的表达约占细菌总蛋白的 20%,主要以可溶形式表达。用镍螯合树脂对所表达的PSCA-TRX融合蛋白进行亲和层析纯化,纯度可达90%。其次,进行了体外DC的分离培养和表型鉴定。利用密度梯度离心法用淋巴细胞分离液Ficoll-Hypaque(密度1.077±0.001g/ml)从正常人抗凝外周血中分离出单个核细胞 (peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。37℃、 5%CO2孵箱内贴壁2h,加入重组的人源细胞因子GM-CSF和IL-4,培养 7?