论文部分内容阅读
禽流感(Avian Influenza)是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的一种禽类(家禽和野禽)的感染和／或疾病综合征。此病呈世界性流行，给养禽业造成巨大的经济损失。禽流感病毒核蛋白(NP)基因在A型流感病毒中同源性较高，保守性强，核蛋白具有型特异性，是流感病毒划分为A、B、C型的主要依据。核蛋白是一种多功能RNA结合蛋白，在病毒复制过程中，在细胞中出现时间较其他结构蛋白早，又是细胞免疫的靶抗原，可诱导机体产生细胞毒性T淋巴细胞反应，因此建立以NP蛋白为诊断抗原的血清抗体检测方法可检测各种亚型的禽流感，对禽流感的早期诊断具有重要意义。 本研究首先将H5亚型禽流感NP完整编码基因(1497bp)插入原核表达载体pGEX-6p-1，构建了pGEX-6P-NP原核表达质粒，经酶切、PCR扩增和测序分析确证其正确插入到表达载体中，且阅读框正确。重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达，用SDS-PAGE电泳分析表达蛋白，但未见明显的目的条带，具体原因未知。 亚克隆核蛋白主要抗原域的基因片断(984bp)，插入原核表达载体pET-28a(+)中，构建了pET-28-NPf原核表达质粒，经鉴定，阅读框正确。经终浓度为1.0mmol／L的IPTG对工程菌进行不同时间的诱导时，在一定时间内随着诱导时间增长，融合蛋白的产量逐步提高，5h左右表达量到达高峰。表达产物的分子质量分别约为42kU，与理论推测的蛋白分子质量一致：免疫印迹试验表明，重组蛋白可被标准禽流感病毒阳性血清所识别，说明表达的融合蛋白具有良好的免疫原性和特异性。 对工程菌扩大培养、诱导，对收集诱导表达的菌体，分离包涵体，分别用尿素和TritonX-100洗涤包涵体，用尿素溶解包涵体，复性液稀释变性蛋白，缓冲液透析获取纯化蛋白。SDS-PAGE分析电泳结果表明，尿素和Triton X-100均可洗去部分杂蛋白。ELISA试验测定的结果显示，与复性前变性蛋白生物活性相比，复性后的纯化蛋白与AIV阳性血清反应的特异性得到明显的提高。因此，可以批量生产基因工程诊断抗原来取代全病毒抗原为AI的诊断提供研究基础。 用纯化的重组蛋白作为包被抗原包被酶标板，建立了检测禽流感病毒抗体的间接ELISA方法，抗原包被浓度为2.5μg／mL，血清最佳稀释度为1：160，二抗最佳稀释度为1：5000。通过重复性试验、交叉试验、特异性试验、稳定性试验等试验结果表明该方法具有重复性好、特异性强、灵敏度高等优点。 本研究建立的间接ELISA抗体检测方法，能够区分携带H5NI禽流感病毒血凝素、神经氨酸酶和鸡白介素-18基因的禽痘病毒活载体疫苗免疫的免疫抗体和AIV全病毒免疫的抗体或自然感染抗体。因此可以用来作为该活载体疫苗的一种配套检测方法。