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背景及目的： p21激活激酶（p21-activated kinases，Paks）是小G蛋白Rho家族Rac和Cdc42重要的下游效应分子，为一类丝氨酸/苏氨酸激酶，参与调节细胞骨架重构和细胞运动等多种生物功能。PAK1即p21小GTP酶活化激酶1，属于I类Paks之一，是第一个被克隆和验证的丝氨酸/苏氨酸蛋白质磷酸化激酶家族成员，与细胞的分裂、凋亡、和基因的转录密切相关。PAK1只在脑、肌肉和脾脏正常组织表达，其他组织表达很少。近年来，越来越多的研究表明，在多种恶性肿瘤如乳腺癌、卵巢癌及胃肠癌等中PAK1的过度表达或过度活化通过多种不同机制促进了肿瘤的恶性进展，而在人类胰腺癌中PAK1的表达情况及作用机制还不十分明确。众所周知，胰腺癌是全世界第五大常见的肿瘤，占全部癌症死因的第四位，是恶性程度最高的肿瘤之一。胰腺癌总的五年生存率很低，其中位生存期不超过半年。高死亡率的胰腺癌很大程度上归因于缺乏可靠的早期诊断方法及其对常规治疗的耐药性。目前为止，胰腺癌最有效的治疗方法仍是手术治疗，然而由于胰腺癌较少能早期发现，能获得手术切除者不足20％，手术切除率较低，即使已切除很多患者最终也因复发和转移而结束生命，80％的患者在根治性切除术后2年内发生局部复发。目前迫切需要寻找新的分子治疗靶点或预后标志物改善胰腺癌患者的生存。因此，为了解PAK1在人类胰腺癌中的表达情况及与临床等相关因素的关系，本实验将从人类胰腺高、中、低分化癌组织、胰腺癌肝转移癌组织及胰腺癌细胞株水平检测 PAK1蛋白的表达并分析其与胰腺癌临床病理特征及生存期的关系，同时，拟应用基因转染技术进一步探讨PAK1在胰腺癌的发生发展及侵袭过程中的作用。应用载体转染方法使PAK1在细胞中表达上调，来观察PAK1在体外胰腺癌细胞增殖、侵袭、转移中的作用。 材料和方法： 1.原发性及转移性胰腺癌组织标本 收集2005年5月-2012年12月间中山大学附属肿瘤医院及广州医科大学附属肿瘤医院胰腺癌及肝转移标本92例，其中72例为胰腺癌手术切除标本，20例肝转移癌标本（包括9例肝转移癌切除标本和11例肝转移癌穿刺活检标本）。患者临床病理资料包括性别、年龄、发病部位、组织学类型、淋巴结转移和病理分期均摘自患者病历资料。根据WHO标准，由两位病理诊断医师确定病理诊断、组织学类型、淋巴结转移、临床病理分期。采用免疫组化(S-P法)技术在组织蛋白水平检测胰腺癌及胰腺癌肝转移组织中PAK1表达情况。PAK1的阳性部位主要在细胞浆内，根据肿瘤阳性细胞数分为＜5%为0分，5%-25%为1分，25%-50%为2分，50%-75%为3分，＞5%为4分。根据着色强度分为：无色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。两项合计乘积＜4分定义为PAK1低表达，≥4分定义为PAK1高表达。同时进行Kaplan-Meier生存分析，应用cox回归模型分析预后因素，采用SPSS16.0统计软件包进行统计学处理。 2.胰腺细胞培养 将冻存于液氮的panc-1、Capan-2、ASPC-1、K-Ras E6E7及E6E7细胞复苏，其中panc-1、 Capan-2、 ASPC-1、 K-Ras E6E7是胰腺癌细胞株，E6E7细胞为一种正常胰腺上皮细胞。然后panc-1、K-Ras E6E7及E6E7均用DMEM培养液(含有10％新生牛血清，100 u／ml的青霉素和100ug／ml的链霉素)，Capan-2细胞用MyCos,5A培养液， ASPC-1细胞用RPMI1640培养液，均在37℃，5％CO2饱和湿度条件下培养，细胞单层贴壁生长，待生长到覆盖率为70%～80%时，用含0.25%胰蛋白酶和0.02%乙二胺四乙酸二钠(Ethylenediamine Tetraacetic Acid Disodium，EDTA)的胰酶消化传代。 3. Western blot检测 收集对数生长期细胞进行蛋白提取用于实验。提取各细胞蛋白，根据蛋白的分子量制备不同浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶，每孔上样量50ug，常规电泳、转膜、封闭，一抗4℃过夜孵育及相应二抗37℃孵育l h，DAB显色，β-actin作为内对照。 4.上调Capan2中的PAK1表达量以观察其对胰腺癌细胞生物学行为的影响上一步实验已证明Capan2的PAK1表达量较低，故采用基因重组技术及限制性内切酶技术构建表达载体pcDNA3.1-PAK1，经鉴定后通过脂质体lipo2000转染至Capan2中，用含1mg/ml G418的MyCos,5A培养液培养后通过Westem-blot确定Capan2细胞中PAK1高表达成功。以空载转染细胞作为对照，通过MTT、细胞划痕实验及transwell实验，观察两组细胞的生物学行为差异。 结果： 1．免疫组织化学(S-P)染色显示： PAK1的阳性部位主要在细胞浆内，72例原发性胰腺癌标本及20例胰腺癌肝转移标本中PAK1高表达率分别为52.8%(38/72)和25%（5/20），两者具有统计学差异((P<0.05)。在72例原发性胰腺癌标本中PAK1高表达与年轻人群及病理分化好差异具有统计学意义(P<0.05)，生存曲线分析表明胰腺癌PAK1高表达者具有更长的生存期(p<0.005)。同时单因素及多因素cox回归模型分析证明PAK1是胰腺癌独立的预后因素(P<0.005)。 2．Western-blot结果显示： 与正常胰腺上皮细胞E6E7相比，PAK1在panc-1、Capan-2、K-Ras E6E7不同胰腺癌细胞株中均呈现低表达状态。除ASPC-1细胞中PAK1的表达与正常胰腺细胞株中的表达无明显差异外，其余胰腺癌细胞PAK1均为低表达。其中，以K-Ras E6E7细胞中PAK1表达水平最低。 3．高表达PAK1对胰腺癌细胞株生物学行为的影响 持续使用G418进行筛选后，转染pcDNA3.1-PAK1进行扩增，最终成功构建高表达PAK1的Capan2细胞（命名为PAK1组），通过Westem-blot进行检验，结果表明，Capan2的PAK1组表达水平较空载转染的Capan2（命名为对照组）显著升高(P＜0.05)，通过 MTT法检测两组细胞体外增殖情况。PAK1组和对照组在不同时间点的增殖速度有显著差异(P＜0.05)。PAK1组随着时间的推移，增殖速度减慢，与对照组比较有显著统计学差异(P＜0.05)。 细胞体外迁移和侵袭小室检测高表达特异性 PAK1蛋白后细胞迁移侵袭能力。迁移实验结果表明， PAK1组细胞体外运动能力明显低于对照组细胞(P＜0.05)；此外，侵袭实验结果也表明，与对照组细胞相比，PAK1组细胞的侵袭能力亦是明显降低(P＜0.05)。 结论： 1．高表达的PAK1是胰腺癌独立的预后因素，与胰腺癌的生存成正相关。 2．利用质粒介导的基因转染技术成功构建了PAK1高表达的胰腺癌细胞株，初步探讨了PAK1的表达对胰腺癌细胞在体外的生物学行为的影响，发现PAK1能抑制胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。