论文部分内容阅读
褪黑素(melatonin,MT)是一种吲哚胺类神经内分泌激素，在人和哺乳动物主要由松果体分泌，接受中枢神经系统下丘脑视交叉神经上核(Suprachiasmatic Nuclei，SCN)的调控。SCN-松果体-MT系统主要调控机体的生物节律，以往研究发现SCN参与调控牙本质的节律性形成；也有学者提出巨牙症可能与松果体肥大及褪黑素分泌异常有关；最新研究发现成釉器细胞及成牙本质细胞表达褪黑素受体MT1。褪黑素是否参与牙齿的发育值得探讨。褪黑素的生物学作用广泛，除调节昼夜节律外，还可抗氧化、抗衰老，抗肿瘤，调节生长发育，增强免疫力等。近年来发现褪黑素具有调节骨代谢的作用，能够促进骨质形成、骨折愈合及牙种植体周围的骨整合；体外可促进成骨细胞的分化，促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化。因此，褪黑素可能是除甲状旁腺素外又一与钙调节有关的激素。牙本质的形成与骨质相似，均为细胞外基质蛋白分泌及羟基磷灰石沉积的过程，因此我们推测褪黑素在牙本质形成过程中也可能起作用。牙乳头细胞(DPCs)是未分化的外胚间充质细胞，是牙髓细胞与成牙本质细胞共同的前体细胞，参与牙本质的形成及修复过程，在牙齿发育及牙髓损伤修复中发挥重要作用。本实验通过体外培养大鼠牙乳头细胞(ratdental papilla cells，RDPCs)，观察褪黑素受体MT1、MT2在RDPCs中的表达分布，研究褪黑素对体外培养RDPCs增殖、分化的影响，并进一步观察MT受体拮抗剂Luzindole对MT作用的影响，初步探讨其作用机制。
目的：检测体外培养RDPCs是否表达褪黑素受体MT1、MT2；研究生理浓度褪黑素对RDPCs增殖、分化的影响，并进一步观察MT受体拮抗剂对其作用的影响，初步探讨其作用机制。
方法：⑴SD大鼠牙乳头细胞的分离培养：采用组织块法分离培养新生1天SD大鼠下颌第一磨牙牙乳头细胞，差别消化法纯化细胞。⑵免疫细胞化学技术检测褪黑素受体MT1、MT2在RDPCs中的表达分布。⑶MTT比色法检测生理浓度褪黑素对RDPCs增殖的影响：①检测普通培养条件下，不同生理浓度褪黑素：10-12mol/L(低浓度组)、10-10mol/L(中浓度组)、10-8mol/L(高浓度组)，在作用24h、48h、72h、96h后各组RDPCs的OD490nm值，并计算各组RDPCs的增殖率。对照组不加褪黑素。②在矿化诱导条件下检测褪黑素对RDPCs增殖的影响，检测指标同上。③在以上两种条件下，中浓度组加入褪黑素受体拮抗剂2μmol/L Luzindole，72h、96h后检测两组OD490nm值有无变化。⑷RDPCs分化实验：①ALP活性检测试剂盒检测不同浓度褪黑素作用3天后，各组RDPCs的ALP活性(OD520nm值)。并在高浓度组加褪黑素受体拮抗剂Luzindole(2μmol/L)，观察OD520nm值有无变化。②免疫细胞化学染色检测MT(10-8mol/L)对RDPCs DSP表达的影响：实验分为普通培养组、矿化诱导组、褪黑素组、阴性对照组(PBS替代一抗)。按实验分组加药7天后，免疫细胞化学检测DSP的表达。③Vonkossa和茜素红矿化结节染色检测MT(10-8mol/L)对RDPCs体外矿化结节形成的影响：实验分为普通培养组、矿化诱导组、褪黑素组。按实验分组诱导21天后，分别进行Vonkossa和茜素红矿化结节染色。茜素红染色后，1％盐酸酒精处理5min，酶标仪检测各组OD450nm值。
结果：⑴组织块法及差别消化法可得到纯化的牙乳头细胞。⑵RDPCs表达褪黑素受体MT1，不表达MT2。⑶RDPCs增殖实验：①普通培养条件下加药24h，各组细胞间的增殖率无明显差异；48h后，高浓度组低于其它三组(p＜0.05)；72h后，中、高浓度组低于对照组及低浓度组(p＜0.05)；96h后，实验组均低于对照组(p＜0.05)，且高浓度组低于中、低浓度组。②矿化诱导条件下，在所有时间点，中、高浓度组增殖率均低于对照组及低浓度组(p＜0.05)；72h后，低浓度组增殖率有下降趋势；96h后，低浓度组明显低于对照组(p＜0.05)。③在以上两种培养条件下，中浓度组中加入褪黑素受体拮抗剂后，增殖率无明显变化(p＞0.05)。⑷RDPCs分化实验：①ALP活性检测：高浓度组OD值高于对照组(p＜0.05)，加入拮抗剂Luzindole后，OD值变化不明显(p＞0.05)。②DSP免疫细胞化学染色显示：普通培养组染色阴性，矿化诱导组染色弱阳性，褪黑素组染色强阳性。③Vonkossa染色：矿化诱导组与10-8mol/L褪黑素组均可见红色结节染色，普通培养组无明显结节形成；茜素红染色，两实验组OD值均高于对照组(p＜0.05)，但实验组之间无差异(p＞0.05)。
结论：①本实验采用组织块法体外成功培养了大鼠牙乳头细胞，并用差别消化法获得了纯化大鼠牙乳头细胞。②普通培养及矿化诱导条件下生理浓度的褪黑素均可抑制大鼠牙乳头细胞的增殖，并呈剂量依赖性。③褪黑素可增强大鼠牙乳头细胞ALP活性，促进大鼠牙乳头细胞DSP表达，为进一步研究褪黑素促进大鼠牙乳头细胞分化提供依据。④大鼠牙乳头细胞表面表达褪黑素受体MT1，但褪黑素受体拮抗剂不影响其作用，提示褪黑素对大鼠牙乳头细胞的作用可能不是通过MT1受体介导。