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糖原合酶激酶3(Glycogen Synthase Kinase3,GSK-3)是一类高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,在植物生长发育和逆境响应中起重要信号转导作用。油菜素内酯(brassinosteroid,BR)是一种在植物整个生长发育过程中都起重要作用的植物激素。植物缺乏BR,会导致体型矮小、延迟花期和衰老、顶端优势降低以及黑暗中光形态建成等。模式植物拟南芥基因组共有10个GSK-3基因,有3个拟南芥GSK-3已被证明参与BR信号转导,其中BIN2在BR信号转导途径中起关键负调节因子的作用,但目前还没有有关大豆BIN2类似基因功能的研究。
通过此项研究,我们通过RACE技术克隆了大豆BIN2类似基因Gm BINL1(Brassinosteroid-Insensitive2 Like,BINL1),研究了其在植物生长发育和逆境响应方面的功能。获得如下结果:
(1)基于EST序列比对,通过5和3RACE(Rapid amplification of5and3,Cdna ends)技术获得了大豆BIN2类似基因(命名为Gm B/NL1)全长Cdna序列。GmBINL1基因全长Cdna序列为1143bp,编码含380个氨基酸的蛋白质,预测其蛋白质分子量约为48KD;可能是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。通过NCBI的同源性比对分析得知,GmBINL1属于GSK-3蛋白家族成员,从GmBINL1蛋白与AtBIN2蛋白序列比对可知,GmBINL1蛋白与AtBIN2蛋白高度同源。
(2)生物信息学分析表明:大豆基因组至少有22个GSK-3基因,是由四个基因进化而来,在大豆基因组中有7个BIN2类似基因,即Gm BINL1-GmBINL7。
(3)实时荧光定量PCR(Qrt-PCR)分析表明:GmBINL1-GmBINL7在10天龄大豆幼苗幼苗期的顶芽、上胚轴、下胚轴、子叶、主根和侧根表达,在60天龄大豆的幼叶、成熟叶、茎、主根、侧根、荚、种子和花都有表达;其中GmBINL4在侧根和花中的表达量相当高。
(4)亚细胞定位实验表明:GmBINL1主要定位于细胞核,少量定位于细胞质和细胞膜。
(5)原核表达实验表明:GmBINL1能在细菌中表达,但在本研究的实验条件下以包涵体的形式表达。
(6)遗传和生理实验分析表明:和野生型相比,在拟南芥体内过表达野生型和突变GmBINL1基因对植物根系生长、叶片形状、植物生长高度等方面没有明显影响。转基因植物对激素BR、IAA和GA的响应没有发生改变,说明GmBINL1可能不参与BR、IAA以及GA的信号转导;过表达野生型GmBINL1和突变Gm BINL1基因影响拟南芥对逆境的响应,和野生型相比,转基因材料对LiCl胁迫处理的抗性增强;在侧根形成方面,过表达GmBINL1及突变Gm BINL1基因拟南芥对NaCl、蔗糖和山梨醇处理的敏感性略下降。
综上所述,本研究克隆了大豆GSK-3基因家族成员Gm BINL1,研究了其表达模式、定位以及对植物生长发育和逆境响应的影响,为将来深入研究GSK-3对植物生长发育的影响打下了基础。