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CT10激酶调节子样蛋白(regulator of kinase like protein，CRKL)是CRK调节蛋白家族中的一员，因与CRK基因有60％的同源性，编码分子量为39KDa的蛋白质，具有一个SH2和两个SH3结构而将其命名为CRKL(CRK-like)基因。CRKL作为信号传导蛋白通过SH2识别磷酸化酪氨酸和SH3结构域识别脯氨酸富集区而发挥作用。
CRKL基因已被定位于22q11.21，并已被证明其在H1819，H552两种肺癌细胞系中存在基因扩增，另外敲除CRKL则可抑制细胞侵袭和迁移能力，提示CRKL在肺癌的侵袭和迁移中发挥着重要作用，但是机制尚不清楚。本研究目的旨在探讨:在非小细胞肺癌中，CRKL通过激活ERK信号通路而促进转录因子c-fos与MMP9的启动子结合，使MMP9表达上调，促进肺癌细胞的侵袭。
材料和方法：
1、组织来源
具有完整随访资料的56例NSCLC原发灶和对应的淋巴结转移灶组织，来自于2003年到2005年在中国医科大学附属第一医院实行手术切除，并经病理诊断和分型后的存档蜡块，组织经10％中性福尔马林固定、石蜡包埋。蜡块组织的使用获得了伦理委员会的同意和许可。所有患者在术前均未接受过放化疗。
2、免疫组织化学染色将石蜡组织块切成4μm厚切片，脱蜡，脱水，按S-P法和抗体说明操作。抗CRKL的多克隆抗体（1∶250，Novus biologicals），抗MMP9的多克隆抗体(1∶100，Sigma)，采用Elivision试剂盒(MaiXin，China)，以PBS代替一抗作为空白对照。选肿瘤细胞阳性染色集中区域，每张切片计数400个癌细胞，由两名病理医师双盲观测。结果判定: CRKL免疫组化阳性信号定位:原发灶中位于细胞核或核/浆，淋巴结转移灶中位于细胞浆中;MMP9免疫组化阳性信号定位:细胞浆。表达百分率分为以下4个等级:1-25％为1分，26-50％记为2分，51-75％记为3分，76-100％记为4分。根据免疫组化染色强度分为3个等级:无着色或仅微弱着色记为0分，淡黄色颗粒着色记为中度1分，棕褐色颗粒强着色记为2分。以阳性细胞率和染色强度的分值乘积作为每一例的积分:＜4为阴性;≥4为阳性。
3、细胞培养与转染选择CRKL低表达的两种细胞系:正常支气管上皮细胞系HBE和肺癌细胞系H1299（购自ATCC），均用含10％热灭活新鲜小牛血清RPMI1640(Gibco，USA)、100U/ml的青霉素、100U/ml的链霉素的培养基，在37℃、5％CO2的条件下培养。p-CMV-CRKL与p-CMV-empty vector购自Origene。转染前24小时将细胞按50％密度接种于24孔板，采用attractene转染试剂进行转染，转染后48小时使用Westernblot检测转染效率。
4、Western blot检测收集培养细胞，加入裂解液充分裂解，低温高速离心(4℃，12000转/min，30min)，提取上清为总蛋白。上样蛋白量为60ug。电泳（12％SDS-PAGE凝胶）、转印(50V,120min)、5％正常小牛血清封闭，抗CRKL(1∶500，Millipore)、和抗β-actin(1∶1000，Santa Cruz Biotechnology, USA)，4℃孵育过夜，分别与对应的二抗(1∶2500，santa cruz，USA)室温孵育2h，ECL显色，结果经自动电泳凝胶成像分析仪（Chemi Imager5500，Alpha Innotech，USA）采集，进行灰度值测定。
5、RT-PCR分析转染CRKL24小时后收集细胞，使用trizols试剂提取RNA，采用ABI highcapacity cDNA RT kit(Applied Biosystems)进行反转录。使用ABI7900实时定量PCR仪，检测CRKL、MMP9、c-jun、c-fos的表达情况，内参采用beta actin。
6、细胞侵袭能力检测用预冷无血清RPMI1640培养基以1∶5稀释Matrigel（BD Biosciences，USA），将转染后24小时后的细胞制成细胞悬液，调至细胞密度为2.5×10个/ml，取100μl加入上室(孔径8um，Costar，USA)，下室加600μl含10％小牛血清1640培养基。37℃、5％ CO2孵箱中培养18小时后吸尽培养基，PBS清洗后，甲醇室温固定15min，用棉签轻擦掉上表面的细胞，苏木素染色，室温干燥过夜。取下微孔膜，至载玻片上，镜下计数细胞数，实验重复3次，取均值。
7、染色质免疫共沉淀用37％甲醛处理细胞，收集细胞，超声破碎，加入目的蛋白的抗体c-jun(1∶100, Santa Cruz Biotechnology)、c-fos(1∶200, Santa Cruz Biotechnology)，与靶蛋白-DNA复合物相互结合，加入Protein A，结合抗体-靶蛋白-DNA复合物，并沉淀，对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合，洗脱，得到富集的靶蛋白-DNA复合物，解交联，纯化富集的DNA片断，进行PT-PCR分析，将扩增的DNA产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。
8、AP-1报告基因检测吸尽细胞培养液后可以直接加入报告基因细胞裂解液，充分裂解后，10，000-15，000g离心3-5分钟，取上清用于测定。融解荧光素酶检测试剂，并达到室温。开启荧光测定仪，将测定间隔设为2秒，测定时间设为10秒。每个样品测定时，取样品20-100微升，加入100微升荧光素酶检测试剂，用枪打匀或用其它适当方式混匀后测定RLU(relative light unit)。以报告基因细胞裂解液为空白对照。
9、数据分析
采用SPSS10.0统计分析软件，对CRKL过表达和MMP9过表达的关系用卡方检验;其他实验结果采用t检验进行数据分析，用mean±SD表示， P＜0.05为差异有意义。
结果：
1、CRKL蛋白在非小细胞肺癌的淋巴结转移灶中的表达明显高于原发灶免疫组化结果显示CRKL在原发灶中阳性表达为核或核/浆，而在淋巴结转移灶中为浆表达。CRKL在淋巴结转移灶中的阳性表达率为80.4％(45/56)，明显高于原发灶阳性表达率55.4％(31/56)。另外，原发灶CRKL表达为阴性的病例中，有18例出现其对应的淋巴结转移灶CRKL阳性表达，其中有13例为中等阳性、5例为强阳性;只有4例病例是原发灶为CRKL表达阳性而对应的淋巴结转移灶为阴性表达。
2、CRKL通过MMP9促进肺癌细胞的侵袭Transwell小室侵袭实验结果显示过表达CRKL使HBE和H1299两种细胞侵袭能力增强(HBE control vs CRKL(∶)65±5vs130±6，p＜0.05; H1299 control vs CRKL(∶)78±8vs170±5，p＜0.05)。在筛查了一系列可能与肿瘤侵袭有关的因子的变化:beta-catenin，E-cadherin，P120-catenin，TIMPs和MMPs，发现只有MMP9的mRNAs水平明显增加。当使用MMP9中和抗体(15μg/M1，2 hours)处理细胞后，细胞侵袭能力下(by69％，in H1299 and70％，in HBE)。同时我们还对56例原发灶组织进行了MMP9免疫组化染色，发现有39(69.7％)例出现阳性表达，主要位于细胞浆，更为重要的是我们发现在非小细胞肺癌中，MMP9的阳性表达与CRKL过表达与正相关。
3、CRKL可以激活ERK信号通路我们使用AP-1报告基因检测技术发现:CRKL可以上调AP-1报告基因活性，说明CRKL可以激活ERK信号通路。WB技术检测已转染CRKL的细胞中MAPK家族成员:ERK1/2，JNK，and p38 MAPK的蛋白表达量，结果显示:CRKL过表达可以明显增加p-ERK1/2的蛋白含量，但是JNK和p38 MAPK的蛋白含量并没有改变。当使用ERK信号通路抑制剂(20μmol/L，2 hours)处理细胞后，可以逆转上述CRKL的促进作用。
4、CRKL通过ERK信号通路上调MMP9的表达转染CRKL可以上调ERK信号通路下游靶基因MMP9，c-jun和c-fos的mRNA和蛋白水平的表达。我们使用染色质免疫共沉淀检测发现:转染CRKL能够增加HBE和H1299两种细胞内转录因子AP-1与MMP9启动子区域AP-1结构域的结合力，因而CRKL可以促进MMP9的转录。同时使用ERK信号通路抑制剂(20μmol/L，2 hours)处理细胞后，MMP9的转录和表达受到抑制。
5、CRKL通过ERK-MMP9促进细胞侵袭Transwell小室侵袭实验结果显示在HBE和H1299两种细胞中转染CRKL后，可以明显增加细胞的侵袭能力;但是，当使用ERK信号通路抑制剂(20μmol/L，2hours)处理细胞后，细胞侵袭的作用受到明显抑制。
讨论：
许多研究显示磷酸化形式即活化的CRKL在许多上皮肿瘤中存在过表达，并且CRKL可能与肿瘤的转移密切相关即可以促进肿瘤细胞的侵袭和迁移。最近的研究发现CRKL在H1819，H552两种肺癌细胞系中存在基因扩增，敲除CRKL则可抑制细胞增殖，周期，侵袭和迁移能力，提示CRKL在肺癌的侵袭转移中发挥着重要作用，但是机制尚不清楚。在本研究中，我们首先证实了CRKL能够通过上调MMP9而促进肿瘤细胞的侵袭能力，并进一步证实CRKL能够激活ERK信号通路，进而提示我们:CRKL作为促癌基因，很大意义上，可能是通过ERK-MMP信号通路轴来发挥其促进肿瘤侵袭的作用。
我们之前的工作已经证实，在有淋巴结转移的非小细胞肺癌的病例中CRKL的阳性表达率为31(55.36％)明显高于无淋巴结转移25(44.64％)者(P=0.0273)。在本次研究中，我们通过免疫组化的方法对比56例肺癌原发灶和相应的淋巴结转移灶中CRKL的表达情况，发现CRKL在淋巴结转移灶中阳性表达率80.4％(45/56)明显高于原发灶的55.4％(31/56)，18例原发灶CRKL为阴性表达的病例中，其对应的淋巴结转灶却为中等强度以上的阳性表达。这是因为原发灶中免疫组化染色CRKL阴性的区域，当其发生淋巴结转移过程中，产生了肿瘤细胞的异质性，导致了在淋巴结转移灶中CRKL表达阳性。因此，CRKL过表达异质性可能是CRKL促进肿瘤细胞的侵袭能力原因之一。
为了揭示CRKL是如何促进肺癌细胞侵袭转移的分子机制，我们选取了CRKL低表达的H1299肺癌细胞系和正常支气管上皮细胞系，进行转染CRKL质粒后，检测了可能与肿瘤侵袭有关的分子如E-ca, beta-catenin，p120 catenin，MMPs，TIMPs等，结果发现转染CRKL只对MMP9的转录和蛋白表达有影响。已有报道指出MMP9与肺癌的浸润、淋巴结转移密切相关，而MMP9的表达水平与基因的激活，酶原的激活，以及内源性众多的癌基因和抑癌通路的相互复杂作用而起到的失活作用等多种因素相关。在这里，我们发现MMP9的阳性表达与CRKL过表达正相关，并首次证明了CRKL可以促进MMP9的表达，可以将CRKL作为MMP9一个新的转录调控因子。
我们已在多种肿瘤中发现有MEK/ERK信号通路的激活。而MEK/ERK信号通路的激活是许多肿瘤侵袭、迁移的重要原因之一，该信号通路包括小GTP结合蛋白Ras和下游的丝氨酸/苏氨酸激酶Raf-1，丝裂原活化调节激酶MEK1/2和细胞外调节激酶ERK1/2。虽然有文献报道CRKL可以激活MEK/ERK信号通路，但只是在血液肿瘤，如慢性粒细胞性白血病(CML)中得到研究证实，然而却从未在实体肿瘤中研究过，例如肺癌。MEK/ERK信号通路可以激活转录因子AP-1家族，该家族成员包括c-Fos和c-Jun;而c-Fos和c-Jun可以激活MMPs的转录，这些已有的研究结果提示我们:CRKL发挥其促进肺癌侵袭转移和上调MMP9表达的功能，很可能是通过激活ERK信号通路而实现的。为了证明上述猜想，我们首先证实了过表达CRKL后，肺癌细胞中反映ERK信号通路活性的AP-1报告基因活性确实出现了明显的上升;我们也证实了CRKL可以上调ERK信号通路下游靶基因c-fos和c-jun的转录和表达。另外，染色质免疫共沉淀检测也发现过表达CRKL使AP-1与MMP9启动子结合能力增强。然而，加入ERK信号通路抑制剂PD9805后，则可逆转上述实验结果并且抑制了细胞的侵袭力。这些结果共同证实了ERK级联信号通路的激活介导了CRKL促进MMP9的表达和肺癌细胞的侵袭能力。
肿瘤的侵袭和转移是一个非常复杂的过程，参与的因素有很多。在这里，我们虽然证明了MMP9是CRKL的下游靶基因，CRKL可能作为MMP9的一个新的转录调控因子，并通过激活ERK信号通路而实现，但仍然不能排除CRKL通过其他途径而发挥其对肿瘤细胞侵袭转移的影响，关于这方面的机制仍需进一步的研究和探讨。
结论：
1、过表达CRKL促进肺癌肺癌细胞的侵袭能力。
2、CRKL通过调节ERK信号通路，进而调节MMP9，影响细胞侵袭。