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研究背景:哮喘是一种以可变的气流受限为特征的慢性肺部疾病,除了支气管收缩、气道炎症之外,气道重塑也是参与疾病进展的关键机制。气道重塑是由反复损伤及异常修复引起,与疾病严重程度及肺功能障碍有关,是难治性哮喘的病理基础。气道重塑是指各种气道组分发生进行性重构,包括管壁增厚、管腔狭窄、上皮细胞损伤和脱落、杯状细胞增生、成纤维细胞堆积和平滑肌肥大等。上皮细胞是哮喘初始反应的关键环节。在多种细胞因子刺激性下,上皮细胞失去细胞极性,穿过基底膜并迁移到上皮下区域,转变为肌成纤维细胞,这个过程被称之为上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）。EMT发生不仅是上皮屏障损伤的主要因素之一,也是气道粘膜下肌成纤维细胞的一个重要来源。支气管上皮细胞可通过EMT参与调控哮喘气道重塑,这点在体外实验、动物模型及人类组织学标本均发现证据支持。转化生长因子β1（transforming growth factorβ1,TGF-β1）作为诱导EMT的经典细胞因子,被证实可以诱导支气管上皮细胞EMT发生,促进哮喘气道纤维化重塑。白细胞介素-27（Interleukin-27,IL-27）为IL-12家族成员。它由一条α链（EBI3）和一条β链（p28）构成的异二聚体细胞因子,其受体IL-27R由gp130和IL-27Rα组成。抗原提呈细胞活化后产生IL-27,IL-27通过与靶细胞膜上IL-27R结合,激活相关信号通路如Janus激酶（Janus kinase,JAK）/信号转导和转录激活因子（signal transducer and activator of transcription,STAT）通路,发挥生物学效应。既往研究表明,IL-27可以减轻卵清蛋白（ovalbumin,OVA）诱导的小鼠哮喘模型的气道炎症及气道高反应性,OVA诱导的IL-27Rα-/-小鼠气道炎症显著增强,但IL-27对哮喘气道重塑相关研究甚少。另有研究表明IL-27可抑制不同细胞如肺泡上皮细胞、非小细胞肺癌细胞及滋养层细胞的EMT过程,然而其对参与哮喘气道重塑的支气管上皮细胞EMT作用尚不清楚。STAT3通路作为IL-27信号传递的下游通路,在EMT过程中也具有重要调控作用。小鼠白血病病毒前病毒整合位点1（Provirus integration site for Moloney murine leukemia virus 1,PIM1）是一种原癌基因,其编码蛋白PIM1激酶是STAT3通路的效应基因产物,刺激gp130细胞因子受体可以激活STAT3,上调PIM1表达。研究表明,PIM1激酶除了具有抗凋亡作用外,还具有促进EMT发生的作用。因此,我们推测,IL-27可能通过STAT3/PIM1途径调控支气管上皮细胞EMT过程,进而参与调控哮喘气道重塑过程。目的:探讨IL-27对支气管上皮细胞EMT的作用以及相关信号通路机制,以期为哮喘气道重塑治疗寻找有效靶点。方法:1.建立小鼠哮喘模型,检测IL-27的表达并分析IL-27与肺组织EMT标志物的相关性。1.1雌性BALB/c小鼠20只随机分为2组,对照组和哮喘组,每组小鼠10只。1.2最后一次激发小鼠24 h后应用小鼠肺功能仪测定小鼠气道反应性。1.3收集小鼠支气管肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）,计数板统计BALF中细胞总数,瑞氏吉姆萨染色观察并统计嗜酸性粒细胞数量。1.4应用苏木素伊红（Hematein＆Eosin,HE）染色观察气道炎症变化并评分,应用Image Pro Plus 6.0软件测量基底膜周长（Perimeter of basement membrane,Pbm）、上皮总长度、上皮脱落长度（epithelial detachment,ED）、气道壁面积（Area of airway wall,Wat）和平滑肌面积（Area of smooth muscle,Wam）,计算上皮脱落长度占上皮总长度比例（ED%）、气道壁厚度（Wat/Pbm）和平滑肌厚度（Wam/Pbm）。1.5应用过碘酸-希夫（Periodic Acid-Schiff,PAS）染色,观察小鼠气道粘膜杯状细胞增生情况。应用Image Pro Plus 6.0软件测量并计算PAS阳性染色面积/Pbm（APAS+/Pbm）。1.6应用Masson染色,观察小鼠气道周围胶原纤维沉积情况。应用Image Pro Plus 6.0软件测量并计算Masson阳性染色面积/Pbm（AMasson+/Pbm）。1.7应用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）,检测小鼠BALF中IL-27的水平。1.8应用免疫组织化学染色检测小鼠肺组织中EMT分子标志物E-cadherin和α-SMA表达,应用Image Pro Plus 6.0软件测量α-SMA及E-cadherin蛋白表达的积分光密度（Intergrated option density,IOD）。并分析BALF中IL-27水平与E-cadherin及α-SMA IOD值的相关性。2.IL-27对哮喘小鼠气道炎症、气道高反应、气道重塑及EMT的影响2.1雌性BALB/c小鼠30只,随机分为对照组、OVA组和OVA+IL-27组,每组小鼠10只。2.2最后一次激发小鼠24 h后应用小鼠肺功能仪测定小鼠气道反应性。2.3收集并离心小鼠BALF,应用ELISA检测小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13的水平。应用计数板统计BALF中细胞总数,通过瑞氏吉姆萨染色观察并统计嗜酸性粒细胞总数。2.4应用HE染色观察小鼠气道炎症变化,并对肺组织进行炎症评分。应用Image Pro Plus 6.0软件测量Pbm、上皮总长度、ED、Wat和Warm,计算ED%、Wat/Pbm和Wam/Pbm。2.5应用PAS染色,观察小鼠气道粘膜杯状细胞增生情况。应用Image Pro Plus6.0软件测量并计算PAS阳性染色面积/Pbm（APAS+/Pbm）。2.6应用Masson染色,观察小鼠气道周围胶原沉积程度。应用Image Pro Plus6.0软件测量并计算Masson阳性染色面积/Pbm（AMasson+/Pbm）。2.7应用免疫组织化学染色检测小鼠肺组织中EMT标志物E-cadherin和α-SMA表达,应用Image Pro Plus 6.0软件测量α-SMA蛋白及E-cadherin蛋白表达的IOD值。2.8应用实时定量PCR（Quantitative real-time PCR,qPCR）和Western blot方法检测小鼠肺组织中EMT标志物E-cadherin和α-SMA mRNA和蛋白表达水平。2.9应用Western blot方法检测小鼠肺组织中磷酸化STAT3（phosphorylated STAT3,p-STAT3）、STAT3和PIM1蛋白表达水平。3.IL-27对TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞（BEAS-2B）EMT的作用及机制研究3.1检测不同浓度IL-27对TGF-β1诱导的BEAS-2B细胞EMT的作用（1）细胞分组:对照组;TGF-β1组;TGF-β1+IL-27（10 ng/ml）组;TGF-β1+IL-27（20 ng/ml）组;TGF-β1+IL-27（40 ng/ml）组。（2）qPCR和Western blot技术检测细胞中E-cadherin和α-SMA mRNA和蛋白表达水平。3.2检测不同浓度IL-27对TGF-β1诱导的BEAS-2B细胞STAT3/PIM1通路的影响（1）细胞分组:对照组;TGF-β1组;TGF-β1+IL-27（10 ng/ml）组;TGF-β1+IL-27（20 ng/ml）组;TGF-β1+IL-27（40 ng/ml）组。（2）Western blot检测各组细胞中p-STAT3、STAT3和PIM1蛋白表达水平。3.3检测STAT3/PIM1通路在IL-27调控TGF-β1诱导的BEAS-2B细胞EMT中作用（1）细胞分组一:对照组;TGF-β1组;TGF-β1+IL-27组;TGF-β1+IL-27+WP1066（STAT3抑制剂）组;TGF-β1+WP1066组。细胞分组二:对照组;TGF-β1组;TGF-β1+IL-27组;TGF-β1+IL-27+SMI-4a（PIM1抑制剂）组;TGF-β1+SMI-4a组。（2）qPCR和Western blot技术检测细胞中E-cadherin和α-SMA mRNA和蛋白表达水平。（3）Western blot技术检测不同处理组细胞中p-STAT3、STAT3和PIM1蛋白表达水平。结果:1.小鼠哮喘模型构建成功,OVA组小鼠BALF中IL-27表达降低,且其与EMT标志物水平有相关性。1.1与对照组相比,OVA组小鼠气道阻力升高。1.2与对照组相比,OVA组小鼠BALF中总细胞数量及嗜酸性粒细胞数量明显升局。1.3 H＆E染色显示对照组支气管腔规则,OVA组小鼠肺组织可见管腔变窄,上皮细胞脱落,气道壁及气道平滑肌层增厚。与对照组相比,OVA组小鼠炎症评分、ED%、Wat/Pbm和Wam/Pbm明显增加。1.4 PAS结果显示与对照组相比,OVA组小鼠气道上皮APAS+/Pbm明显增加。1.5 Masson结果显示与对照组相比,OVA组小鼠肺组织中AMasson+/Pbm明显增加。1.6 ELISA结果显示与对照组相比,OVA组小鼠BALF中IL-27水平明显降低。1.7免疫组化染色显示与对照组相比,OVA组小鼠肺组织中E-cadherin的IOD下降,α-SMA的IOD增高。OVA组小鼠BALF中IL-27水平与肺组织中Ecadherin的IOD呈正相关,与α-SMA的IOD与呈负相关。2.IL-27对OVA诱导的小鼠气道高反应、气道炎症、气道重塑及EMT的影响2.1 IL-27对OVA诱导的小鼠反应性的影响。OVA组较对照组小鼠气道阻力增加;IL-27干预后小鼠气道阻力较OVA组降低。2.2 IL-27对OVA诱导的小鼠Th2细胞因子水平的影响。OVA组较对照组小鼠BALF中IL-4、IL-5、IL-13水平升高;IL-27干预后上述细胞因子水平较OVA组降低。2.3 IL-27对OVA诱导的BALF中炎症细胞数量的影响。OVA组较对照组小鼠BALF中细胞总数及嗜酸性粒细胞数量升高;IL-27干预后上述细胞数量较OVA组降低。2.4 IL-27对OVA诱导的小鼠肺组织病理学改变的影响。H＆E染色结果显示,与对照组相比,OVA组小鼠可见管腔变窄,气道壁增厚,紊乱,并有断裂,上皮细胞脱落,气道平滑肌层增厚,气管及血管周围大量炎症细胞浸润,IL-27干预后上述表现明显减轻。与对照组相比,OVA组小鼠肺组织炎症评分、ED%、Wat/Pbm和Wam/Pbm增加;与OVA组相比,IL-27组小鼠肺组织炎症评分、ED%、Wat/Pbm和Wam/Pbm降低。2.5 IL-27对OVA诱导的小鼠气道上皮杯状细胞增生的影响。PAS染色观察各组小鼠气道上皮杯状细胞增生情况,与对照组相比,OVA组小鼠气道上皮APAS+/Pbm增加;IL-27干预后,小鼠气道上皮APAS+/Pbm较OVA组降低。2.6 IL-27对OVA诱导的小鼠肺组织胶原沉积的影响。Masson染色观察各组小鼠肺组织中胶原沉积程度,与对照组相比,OVA组小鼠肺组织AMasson+/Pbm明显增加;IL-27干预后小鼠肺组织AMasson+/Pbm较OVA组降低。2.7 IL-27对OVA诱导的小鼠肺组织EMT相关标志物表达的影响。（1）免疫组织化学染色结果显示,与对照组相比,OVA组小鼠肺组织中Ecadherin的IOD下降,α-SMA的IOD增加;与OVA组相比,IL-27干预后小鼠肺组织中E-cadherin的IOD增加,α-SMA的IOD下降。（2）PCR与Western blot结果显示,与对照组相比,OVA组小鼠肺组织中Ecadherin mRNA和蛋白表达下降,α-SMA mRNA和蛋白表达增加;与OVA组相比,IL-27干预后小鼠肺组织中E-cadherin mRNA和蛋白表达增加,α-SMA mRNA和蛋白表达降低。2.8 IL-27对OVA诱导的肺组织中p-STAT3、STAT3和PIM1表达的影响Western blot结果显示,与对照组相比,OVA组小鼠肺组织中p-STAT3和PIM1表达增加,IL-27干预后小鼠肺组织中p-STAT3和PIM1表达较OVA组降低,各组肺组织中总STAT3表达无变化。3.IL-27对TGF-β1诱导的BEAS-2B细胞EMT的影响及机制研究。3.1 IL-27对TGF-β1诱导的BEAS-2B细胞EMT的影响。PCR与Western blot结果显示,与对照组相比,TGF-β1组细胞中E-cadherin mRNA及蛋白表达下降,α-SMA mRNA及蛋白表达增加。与TGF-β1组相比,加入IL-27刺激后细胞中E-cadherin mRNA及蛋白表达增加,α-SMA mRNA及蛋白表达下降。3.2 IL-27对TGF-β1诱导的BEAS-2B细胞中p-STAT3、STAT3和PIM1表达的影响。通过Western blot结果发现,TGF-β1组细胞中p-STAT3、PIM1表达较对照组增加。与TGF-β1组相比,加入IL-27刺激后细胞中p-STAT3、PIM1表达下降。各组细胞中总STAT3蛋白表达无变化。3.3 STAT3/PIM1通路在IL-27抑制TGF-β1诱导的EMT中作用。（1）与不加WP1066相比,加入WP1066可减弱IL-27对E-cadherin表达的上调和α-SMA、p-STAT3、PIM1表达的下调。（2）与不加SMI-4a相比,加入SMI-4a可减弱IL-27对E-cadherin表达的上调和α-SMA、PIM1表达的下调,但对IL-27引起的p-STAT3表达变化无影响。结论:IL-27通过STAT3/PIM1途径抑制TGF-β1诱导的人支气管上皮细胞EMT发生,从而抑制哮喘气道重塑改变。