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创伤弧菌（Vibrio vulnificus）是一种嗜盐性革兰氏阴性菌,广泛存在于全球海洋环境中。它是一种危险的病原体,可引发脓毒血症和软组织坏死,其感染具有发病急、病症发展快以及死亡率高（＞50%）等特点,给人类生命健康带来严重威胁。临床上常规治疗手段为联合使用足量抗生素,针对软组织感染者,一般需进行外科清创手术,坏死严重时要截肢治疗。因此,研制相关预防性疫苗是应对创伤弧菌感染更为理想的措施。创伤弧菌表面的荚膜多糖（Capsular polysaccharides,CPSs）不仅是其主要的毒力因子,并且可以保护细菌免受宿主吞噬细胞的吞噬,减少或避免体内杀菌物质对细菌的损害。创伤弧菌CPSs含有人体细胞表面聚糖中不存在的稀有糖,是研制相关糖缀合物疫苗的理想靶标抗原。来源于生物1型的BO62316与MO6-24是主要的致病血清型,与三分之一的临床感染相关。并且,这两种血清型创伤弧菌CPSs作为潜在的有效糖抗原可用于创伤弧菌BO62316和MO6-24糖蛋白疫苗的制备。基于上述研究背景,本论文第二章以创伤弧菌BO62316荚膜多糖为研究对象,设计并化学合成其荚膜四糖重复片段。在完成创伤弧菌BO62316与MO6-24寡糖抗原合成的基础上,开展创伤弧菌BO62316和MO6-24相关糖蛋白缀合物的合成与初步免疫学活性研究。B族链球菌（Group B Streptococcus,GBS）感染可导致孕妇流产、新生儿患脑膜炎、败血症、肺炎等多种重症疾病。GBS表面的CPSs不仅是其主要的毒力因子,还可以协助菌体躲避宿主免疫系统。根据CPSs结构差异,GBS可至少分为十种血清型（Ⅰa,Ⅰb和Ⅱ-Ⅸ）。其中,la型是引发GBS临床感染的主要血清型之一,导致新生儿和孕妇感染占整体GBS感染的23%,仅次于Ⅲ型。GBS CPSs是研制相关细菌诊断试剂和糖缀合物疫苗的理想靶标抗原。天然荚膜多糖结构具有微观不均一性,通常难以从自然界中分离得到结构均一的寡糖片段。化学合成作为一种可高效获得结构明确的糖半抗原的有效手段,吸引了越来越多化学家的关注。GBS相关寡糖的合成对于糖缀合物疫苗以及GBS诊断试剂的开发具有重要意义。基于上述研究背景,本论文第三章以Ia型GBS荚膜多糖为研究对象,设计并通过高效的分支偶联方法以及唾液酸化三糖的“原位组装”策略化学合成其荚膜五糖重复单元及其二聚体,为相关糖缀合物疫苗的研究以及糖抗原决定簇构效关系的探索奠定基础。Ⅶ型GBS导致的临床发病率相对较低,约占1%,由于在血清学分型检测中仅部分使用Ⅶ型GBSCPS抗血清,因此该血清型发病率可能被低估。基于同样原因,许多地区的GBS血清型分布比例已被修订。此外,Ⅶ型GBS CPS具有独特的抗原决定域,不能与其它血清型GBS诱导的抗血清发生免疫交叉反应。因此,研制一款安全有效的GBS多价糖疫苗应该含有Ⅶ型GBSCPS相关糖抗原。基于上述研究背景,本论文第四章以Ⅶ型GBS荚膜多糖为研究对象,设计并通过发展高效的合成策略以完成其荚膜六糖重复单元及其二聚体的制备,为开展基于合成糖抗原的相关糖缀合物疫苗的研究以及糖抗原决定簇构效关系的探索奠定基础。本论文主要包括以下四个部分:一、论文的绪论部分对创伤弧菌和B族链球菌的流行病学、致病机制和分型等进行概述,并对荚膜多糖相关寡糖的合成及糖疫苗研究做了系统综述。在对这些相关研究总结和分析的基础上,提出了各个课题研究的依据、目标和具体实验方案。二、论文第二章介绍了创伤弧菌B062316荚膜四糖重复片段的首次化学合成,并对创伤弧菌B062316和M06-24两种血清型相关糖缀合物疫苗开展初步免疫活性研究。创伤弧菌B062316 CPS四糖重复单元结构为:α-D-FucpNAc-（1→3）-[α-L-RhapNAc-（1→4）]-α-D-GalApNAc-（1→3）-α-L-QuipNAc。目标分子 2-1的合成具有以下难点:①单体模块均为稀有氨基脱氧糖,需自主合成;②各单体模块均以α-糖苷键连接,糖苷键的立体专一性构建具有较高难度;③N-乙酰氨基-D-半乳糖醛酸中3,4-O-分支的构建和糖醛酸的氧化制备;④乙酰氨基和氨基的正交性保护。通过设计正交保护基,筛选与评估多种糖苷化反应条件及糖基模块组装策略,我们首先组装氨基半乳糖的3,4-O-双分支结构,以此分支三糖为供体,通过[3+1]汇聚式糖苷化策略可高产率地构建创伤弧菌B062316荚膜多糖相关四糖模块2-2,各糖苷化反应的立体选择性较高（α-only）。在合成过程中,我们优化发展了 TEMPO/BAIB氧化反应条件,可以实现含α-D-GalAN结构的一系列二糖、三糖以及四糖的氧化制备。随后,将优化的TEMPO/BAIB氧化反应条件,应用于四糖中间体2-35的氧化,以81%的收率得到糖醛酸产物2-36。最后,经脱除异亚丙基保护基、叠氮还原、位置选择性N-乙酰化及氢化催化四步反应,以58%的总收率顺利得到目标分子2-1。本课题组在之前工作中已实现创伤弧菌M06-24荚膜四糖2-37的合成,在完成寡糖抗原制备的基础上,将2-37与2-1以DSG为交联剂分别与白喉毒素突变体（CRM197）和牛血清白蛋白（BSA）进行缀合,得到创伤弧菌M06-24和B062316相关糖蛋白缀合物2-40、2-41、2-42和2-43,通过MALDI-TOF质谱仪测定寡糖缀合物平均分子量并计算寡糖/蛋白摩尔比,结果显示每个载体蛋白平均连接3-4个合成四糖半抗原。以寡糖-BSA缀合物2-42和2-43为铺板抗原,通过ELISA实验检测寡糖-CRM197缀合物2-40和2-41免疫组小鼠抗血清中糖特异性抗体滴度。免疫结果显示,两种糖蛋白缀合物2-40和2-41均具有免疫原性,可引发针对糖抗原的T细胞依赖性免疫反应,产生高滴度水平的特异性抗体（总IgG与IgG1）。此外,实验结果还表明,创伤弧菌两种血清型M06-24和B062316之间具有弱的免疫交叉反应。综上,创伤弧菌M06-24与B062316的CPS重复单元（2-1和2-37）是潜在有效的糖半抗原,可用于预防性创伤弧菌糖缀合物疫苗的研究。三、论文第三章介绍了 Ia型GBS荚膜五糖重复单元及其二聚体的化学合成。Ia型GBS CPS的五糖重复单元包括二糖主链4-β-D-Galp-（1→4）-β-D-Glcp-(1→和连接到主链3’-O-位的唾液酸化三糖分支α-NeupNAc-（2→3）-β-D-Galp-（1→4）-β-D-GlcpNAc-(1→。在二聚体十糖分子的合成中,以先引入半乳糖3-O-位氨基葡萄糖基团,随后在4-O-位引入葡萄糖分支的构建顺序合成了含半乳糖3,4-O-分支结构的三糖供受体。随后,通过筛选一系列糖苷化反应条件,发现采用p-TolSCl/AgOTf催化体系,以[3+3]汇聚式糖苷化策略可高效实现两个分支三糖的偶联。此外,以p-TolSCl/AgOTf为催化剂,基于硫苷预活化的[1+2+3]糖苷化策略,实现了六糖中间体3-19的“一釜法”高效合成,总产率为69%。对比分步合成策略,“一釜法”合成虽然没有明显提高产率,但是避免了中间体的分离纯化,提高了合成效率。接下来,以唾液酸化二糖为供体,对六糖受体进行[2×2+6]双糖苷化反应,顺利合成全保护十糖分子3-3。实验结果再次证明当唾液酸化三糖,α-NeupNAc-（2→3）-β-D-Galp-（1→4）-β-D-GlcpNAc-(1→,连接于反应活性较低的仲羟基时,采用“原位组装”策略对唾液酸化三糖进行构建以实现寡糖的合成是较为可靠的,这对于含有相同唾液酸化三糖结构的复杂寡糖分子的制备提供了有效的合成策略。接下来,通过五步连续脱保护反应,依次脱除3-3中的羧酸甲酯、噁唑烷酮中的羰基、苄叉、苄基、叠氮基和酰基等保护基,并将反应过程中生成的氨基转化为乙酰氨基,得目标分子3-2,总收率为40%。为进一步对Ⅰa型GBS相关糖抗原免疫决定簇进行构效关系研究,我们通过[2+3]糖苷化策略完成五糖重复单元3-1的合成。全保护五糖中间体3-23采用与化合物3-3相似的脱保护操作,以六步41%的收率得到目标分子3-1。Ia型GBS荚膜五糖重复单元3-1及其二聚体3-2的还原端末端均安装了自由氨基,可与载体分子进行偶联,便于后续GBS糖缀合物疫苗研究。四、论文第四章介绍了 Ⅶ型GBS荚膜六糖重复单元及其二聚体的首次化学合成。Ⅶ型GBS CPS的六糖重复单元包括三糖主链4-α-D-Glcp-（1→4）-β-D-Galp-（1→4）-β-D-Glcp-(1→和连接到主链6"-O-位的唾液酸化三糖分支α-NeupNAc-（2→3）-β-D-Galp-（1→4）-β-D-GlcpNAc-(1→。在前期研究中,本课题组利用多种因素之间的协同效应,即使用优化的p-TolSCl/AgOTf催化体系,结合糖基供体6-O-位大位阻基团的β-位屏蔽效应或酰基的远程参与作用,发展了一种新颖高效的α-D-葡萄糖苷键的构建方法。我们将该方法应用于重复单元全保护六糖中间体4-3的构建,各反应模块经[2+1+1+2]“一釜三步”糖苷化反应,以52%的总收率获得4-3。每步糖苷化反应的立体选择性和区域选择性均是专一的,无其它异构体的生成。最后,依次脱除4-3中的羧酸甲酯、噁唑烷酮中的羰基、苄叉、苄基、酰基和叠氮基等保护基,并将反应过程中生成的氨基转化为乙酰氨基,以五步49%的总收率获得目标六糖4-1。采用相似的糖苷化策略,以[1+2+1+2]“一釜三步”糖苷化反应,实现两个α-葡萄糖苷键与一个β-葡萄糖苷键的一釜构建,完成主链六糖骨架分子4-14的合成,总产率为54%,且无立体异构体的生成。随后,以新合成的六糖为受体,唾液酸化三糖为供体,采用[2×3+6]双糖苷化策略完成全保护十二糖分子4-4的制备。4-4的顺利合成表明上述唾液酸化三糖与反应活性较高的伯羟基相连时,可预先组装该三糖,然后以其为供体进而实现复杂寡糖的合成;相反地,基于前期研究,唾液酸化三糖4-15应避免与反应活性较低的仲羟基受体直接糖苷化偶联。4-4包含的保护基类型与前面的4-3相同,但由于其结构较4-3更加复杂,因此,类似的脱保护反应时间会被适当延长。最后,经相似的五步连续脱保护操作,以41%的总收率得到目标分子4-2。Ⅶ型GBS荚膜六糖重复单元4-1及其二聚体4-2的还原端末端均安装了自由氨基,可与载体分子进行位置选择性偶联,有助于开发抗GBS糖缀合物疫苗和新颖的GBS检测手段。