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目的通过激光共聚焦显微镜活体观察不同发病时期圆锥角膜患者角膜基质细胞密度、形态，角膜神经密度、分布等微观结构变化规律,结合临床组织病理学和免疫组化检测观察圆锥角膜基质细胞变化，分析圆锥角膜浅层基质瘢痕形成机制。方法1、研究对象：选择2011年10月至2013年3月期间于山东省眼科医院就诊的圆锥角膜患者44例（70眼）。根据临床特征并参照谢立信著角膜病学、圆锥角膜评分标准(Keratoconus Severity Score, KSS)及改良Krumeich分类标准（modified Krumeichclassification of keratoconus），将入组的圆锥角膜患者分为初发期组和完成期组。初发期组患者32例（35眼），完成期组28例（35眼）。选取正常健康人20例（20眼）作为对照组。2、激光共聚焦显微镜检查：对入组的圆锥角膜患者通过激光共聚焦显微镜对角膜微观结构进行分层观察和统计。激光共聚焦显微镜主要观察前弹力层下基质细胞（Sub-Bowman stromal keratocyte）、前部基质细胞（Anterior stromal keratocyte）、后部基质细胞（Posterior stromal keratocyte）和基底神经丛（Subbasal nerve plexus,SNP）。观察指标主要包括角膜基质细胞及神经纤维的密度、形态、分布状态等。3、组织病理和免疫组织化学检查:收集完成期圆锥角膜接受角膜移植后的角膜片，进行免疫组织化学检测，检测指标包括波形蛋白（Vimentin），基质细胞激活蛋白（FAP），α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。4、统计方法：采用HRT3共聚焦显微镜Rostock操作软件进行细胞计数，用ImageJ+NeuronJ进行神经纤维计算。采用SPSS19.0统计软件进行数据分析。结果1、患者一般资料：6例（17.1%）初发期圆锥角膜患者出现Vogt线，29例（82.9%）完成期圆锥角膜患者出现Vogt线。13例（37.1%）初发期圆锥角膜患者出现费氏环，33例（94.3%）完成期圆锥角膜患者出现费氏环。8例（22.9%）完成期圆锥角膜患者出现明显的浅层基质瘢痕，初发期圆锥角膜未见浅层基质瘢痕。正常对照组、初发期圆锥角膜组和完成期圆锥角膜组中央角膜厚度分别为553.3±23.4μm，505.8±25.1μm和390.6±72.4μm，行统计学分析结果显示，中央角膜厚度随病情进展逐渐变薄（P＜0.05）。完成期圆锥角膜前后表面曲率同正常对照组比较显著增大（P＜0.05）。2、角膜基质细胞密度：正常角膜、初发期和完成期圆锥角膜前弹力层下基质细胞密度分别为608.9±102.1个/mm2，610.2±149.3个/mm2，508.4±137.0个/mm2，前部基质细胞密度分别为409.9±55.9个/mm2，365.1±47.6个/mm2，301.4±50.8个/mm2，后部基质细胞密度分别为374.5±36.2个/mm2，322.3±41.3个/mm2，254.3±58.7个/mm2。初发期圆锥角膜前弹力层下基质细胞密度无明显降低（P=1.000），完成期圆锥角膜则有明显降低（P=0.036）。圆锥角膜前部基质细胞和后部基质细胞密度随病情进展（从初发期至完成期）逐渐降低（P=0.000，P=0.000）。3、角膜基质细胞形态：①前弹力层下基质细胞：正常角膜前弹力层下基质细胞呈均一暗反光背景下可见的发亮细胞核，不能观察到胞质、细胞轮廓及胶原纤维结构。初发期圆锥角膜前弹力层下基质细胞核排列紊乱，多表现为蟹爪样，部分区域胞体呈现高反射信号，提示角膜基质细胞处于激活状态。完成期圆锥角膜前弹力层下基质透明度广泛降低，基质细胞分布不均，有部分呈激活态的细胞核相连融合。②前部角膜基质细胞：正常角膜前部基质细胞大小均一、分布均匀。初发期圆锥角膜前部基质细胞核变大，呈现蟹爪样激活状态，但激活程度相比前弹力层下基质细胞弱。可见细小交替暗纹，走形不规则。完成期圆锥角膜基质透明度进一步降低，可见高反光的纤维化结构，难辨细胞结构，出现规则平行排列的粗大交替暗纹。③后部角膜基质细胞：正常角膜后部基质细胞形态与前部基质层细胞差异不大。初发期圆锥角膜后部基质细胞分布不均，未见明显激活状态，部分细胞核被交替暗纹分隔。完成期圆锥角膜后部基质部分细胞核被交替暗纹分隔成散点状，高亮细胞核大小不均。初发期圆锥角膜和完成期圆锥角膜在后部基质内未见明显的纤维化表现。4、基底神经丛密度与形态：正常角膜，早-中期圆锥角膜，晚期圆锥角膜基底神经丛总密度分别为2545.9±601.1μm/mm2，2139.6±618.0μm/mm2，1354.1±630.5μm/mm2。初发期圆锥角膜基底神经丛密度相比正常角膜无明显差异（P=0.095），完成期圆锥角膜与正常角膜和初发期圆锥角膜相比明显降低（P=0.000，P=0.000），差异有统计学意义。正常角膜基底神经丛排列紧密均匀，走形平行，分支较清晰。初发期圆锥角膜基底膜神经丛神经排列紊乱，主干增粗屈曲，分支互相交错，粗细不均，部分神经成环状，无法分辨。完成期圆锥角膜基底膜神经丛较初发期圆锥角膜更加紊乱，分支数量明显减少或消失，部分神经主干中断。5、病理组织学和免疫组织化学检测：完成期圆锥角膜前弹力层部分破裂，前部基质纤维板层排列紊乱甚至断裂，部分区域纤维板层缺失，后部基质纤维板层轻度前突变形，无断裂缺失。完成期圆锥角膜中央角膜FAP、vimentin和α-SMA表达阳性。其中FAP和vimentin在角膜全层分散表达，并且在浅层角膜基质内呈过度表达。α-SMA仅在浅层角膜基质内呈过度表达，与FAP和vimentin在角膜浅层基质内表达水平相似。结论1、通过激光共聚焦显微镜活体观察及免疫组织化学的初步研究结果提示：圆锥角膜发病过程中，初发期圆锥角膜前弹力层下基质细胞呈现激活状态，其密度无明显降低。前部及后部基质细胞密度则显著降低，这可能造成初发期圆锥角膜首先出现后部基质抵抗力降低。2、激光共聚焦显微镜观察到圆锥角膜基质内粗大交替暗纹首先出现在初发期圆锥角膜后部基质，随病情进展出现在完成期圆锥角膜前部基质，提示圆锥角膜基质纤维板层形态改变首先发生在后部基质。3、在圆锥角膜发病过程中，中央角膜在眼内压等生物力学作用下不断前突，前部浅层基质胶原板层可能出现断裂或位移的微观结构变化会引发浅层角膜基质细胞活化及细胞外基质异常重构，这在圆锥角膜浅层基质瘢痕形成过程中可能发挥重要的作用。