论文部分内容阅读
海洋微生物生境特殊，具有独特的代谢途径。海洋微生物的次级代谢产物是新药物研究开发的重要资源。如何提高微生物的次级代谢产物的产量，是目前海洋微生物开发亟待解决的问题。近年来，使用诱导子来刺激代谢途径已经成为提高目的产物产量的主要策略之一。
本论文尝试采用诱导子来提高海洋抗肿瘤候选新药去乙酰真菌环氧乙酯(Deacetylmycoepoxydiene，缩写为DAM)的产量，并对诱导机制进行初步的探索。DAM是红树植物内生真菌A123(Phomopsis sp.A123)产生的一种骨架新颖的环氧二烯类化合物。前期研究表明，DAM具有较强的细胞毒性，对Raji细胞株IC50为3.0g/mL，对胃癌AGS细胞株IC50为1.0μg/mL，具有较好的药用开发前景。但是野生菌株发酵产量极低，PDA固体发酵产量仅为0.8mg/L，限制了对DAM的进一步研究。
在前期摇床培养基质优化的基础上，本文选择和制备了16种诱导子，研究了它们在液体培养条件下对DAM高产突变株139的DAM产量的影响，结果表明，白色假丝酵母菌体制备物和壳聚糖具有显著的正调节作用。采用CCD设计响应面实验，得到了壳聚糖诱导子的最佳诱导条件：壳聚糖接种时间为发酵后的144h、浓度100mg/L。DAM最高产量可比空白对照提高36％。进一步对诱导条件进行优化，DAM的终产量可以提高1.5倍，为工业生产上提高DAM产量、缩短生产周期奠定了基础。
为了研究壳聚糖对菌株139诱导过程中发生的生理生化变化，本文对实验组和对照组发酵液分别进行了生物量、DAM产量、残糖的测定以及菌体形态观察的实验。结果显示壳聚糖的加入促进了菌株的一些生理变化，尤其是菌体提前产生了自溶现象。
采用Real-timePCR等技术，初步探讨了壳聚糖提高DAM产量的可能机制。通过简并引物设计，从菌株139中克隆出信号转导蛋白的保守片段，得到G蛋白的α亚基、MAPK蛋白和PKA蛋白的保守序列；通过Real-time PCR检测得出G蛋白的表达量在诱导2h内基本没有变化，5h下调了5.89倍。而MAPK蛋白在诱导1h、2h、5h时分别下调了1.49、2.28、10.57倍；推测诱导作用可能是通过信号转导途径将外界信号传递到细胞核，导致相关基因转录水平变化。其次，在前人研究基础上，探究壳聚糖的加入对DAM合成相关酶的表达变化影响，发现酯酶、细胞色素P450单氧合酶和NAD依赖性的脱水酶这3种后修饰酶在发酵第168h和第216h时伴随着DAM产量的提高均有不同程度的上调。因此推测壳聚糖提高DAM产量的机制可能最终是上调了DAM合成相关基因的转录水平，进而促进DAM的合成。