【摘 要】
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双歧杆菌是重要的益生菌,广泛的应用于食品和药品中。但是贯穿于生产加工、储存销售及摄入消化过程中的酸胁迫严重威胁着双歧杆菌的存活。动物双歧杆菌是耐酸性最强的双歧杆菌,然而其耐酸机制尚不明确。本文以Bifidobacterium animalis subsp.lactis A6（CGMCCNo.9273）为研究对象,利用比较基因组、转录组及基因工程手段探究了动物双歧杆菌的耐酸应答机制。该研究对解析动物
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双歧杆菌是重要的益生菌,广泛的应用于食品和药品中。但是贯穿于生产加工、储存销售及摄入消化过程中的酸胁迫严重威胁着双歧杆菌的存活。动物双歧杆菌是耐酸性最强的双歧杆菌,然而其耐酸机制尚不明确。本文以Bifidobacterium animalis subsp.lactis A6（CGMCCNo.9273）为研究对象,利用比较基因组、转录组及基因工程手段探究了动物双歧杆菌的耐酸应答机制。该研究对解析动物双歧杆菌耐酸应答分子机制,提高双歧杆菌耐酸性与产业化应用具有重要意义。本文主要研究结果如下:（1）评价动物双歧杆菌A6耐酸性。动物双歧杆菌A6酸处理前活菌数对数值为9.42±0.06,pH2.5处理2h后活菌数对数值为9.22±0.17,酸处理后活菌数对数值没有显著下降。长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌在pH2.5的环境中处理2h后活菌全部死亡,而所有的动物双歧杆菌活菌数均能保持活菌数对数值不发生显著的下降。这说明动物双歧杆菌A6具有很强的耐酸性,而且这一特性具有种间特异性。（2）构建动物双歧杆菌特异基因集。利用PacBio测序技术绘制动物双歧杆菌A6的全基因组图谱。其基因组大小为1,958,651 bp,共编码了1622个CDS,52个tRNA,16个rRNA。利用比较基因组的手段比较51株双歧杆菌的全基因组发现动物双歧杆菌具有98个特异基因。（3）确定动物双歧杆菌耐酸响应基因。通过RNA-Seq转录组测序技术检测到动物双歧杆菌在酸性环境中有531个基因发生了转录水平的显著变化。对差异表达基因的功能分析表明动物双歧杆菌A6耐酸应答机制主要有:通过加强脂肪酸的合成和pspA的表达来降低细胞膜的通透性进而阻挡氢离子的进入;通过增强草酸代谢来增强氢离子的消耗;通过增强多糖的利用、核糖的代谢以及双歧途径来增加胞内能量的产生;利用DnaK系统、GroES/EL系统、ClpB来减少蛋白质损伤;利用直接修复及碱基删除修复系统来修复DNA损伤;通过蛋白的磷酸化去磷酸化过程及群体感应系统来进行信号转导从而引发转录因子的变化及翻译水平的下降来调节细胞的全局应答。（4）验证关键耐酸相关基因功能。从动物双歧杆菌的特异基因集及其耐酸响应基因中筛选得到潜在耐酸关键基因。通过构建过表达载体实现目的基因在动物双歧杆菌A6中的过表达。结果发现胁迫响应膜蛋白BAA6＿RS00480,膜蛋白BAA6＿RS06240,未知蛋白BAA6＿RS03885、BAA6＿RS05205的过表达可以分别将动物双歧杆菌A6在酸致死条件下的存活率提高22.43倍,9.58倍,9.62倍,11.58倍。说明这些基因在动物双歧杆菌的耐酸应答中发挥重要作用。
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